土壤与环境微生物研究法

1、 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark0 o Current Document 第七章土壤微生物区系分析92 HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 第一节一般土壤微生物的分离与计数92 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 一、稀释平板法92 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 二、MPN稀释法94 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 三、土粒法96第二节厌氧微生物的分离96 HYP

2、ERLINK l bookmark12 o Current Document 一、充氮厌氧培养法96 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 二、焦性没食子酸吸氧法97 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 三、专性厌氧细菌的分离法98 HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 第三节土壤主要类群微生物的分离与计数99 HYPERLINK l bookmark24 o Current Document 一、好氧细菌的分离与计数99 HYPERLINK l book

3、mark26 o Current Document 二、丝状真菌的分离与计数100三、放线菌的分离与计数100 HYPERLINK l bookmark28 o Current Document 第四节土壤中功能微生物的测定101 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 一、氨化细菌的测定101 HYPERLINK l bookmark36 o Current Document 二、硝化细菌的测定102 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 三、反硝化细菌的测定104 HYPERLINK l bookma

4、rk52 o Current Document 四、好氧性自生固氮细菌的测定105 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 十一、纤维分解菌的测定106 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 十二、光合细菌的测定108 HYPERLINK l bookmark70 o Current Document 十三、甲烷产生菌的测定109 HYPERLINK l bookmark72 o Current Document 十四、有机污染物降解菌的测定110 HYPERLINK l bookmark74 o Cur

5、rent Document 十五、重金属抗性菌的测定111 HYPERLINK l bookmark76 o Current Document 第八章根圈微生物分析111 HYPERLINK l bookmark78 o Current Document 第一节根圈细菌的分析112 HYPERLINK l bookmark80 o Current Document 一、根圈的分区112 HYPERLINK l bookmark82 o Current Document 二、根圈细菌的分离112 HYPERLINK l bookmark86 o Current Document 三、根圈优势菌株

6、的分群114第二节植物组织内微生物的分离115 HYPERLINK l bookmark90 o Current Document 一、植物材料的选择116 HYPERLINK l bookmark92 o Current Document 二、组织表面消毒116 HYPERLINK l bookmark98 o Current Document 三、分离方法117 HYPERLINK l bookmark100 o Current Document 第十五章土壤微生物生物量的测定119 HYPERLINK l bookmark110 o Current Document 第一节土壤样品采集与

7、预处理119 HYPERLINK l bookmark112 o Current Document 第二节土壤微生物生物量碳分析120 HYPERLINK l bookmark114 o Current Document 一、熏蒸提取容量分析法120 HYPERLINK l bookmark134 o Current Document 第三节土壤微生物生物量氮分析124 HYPERLINK l bookmark136 o Current Document 一、熏蒸提取全氮测定法125 HYPERLINK l bookmark142 o Current Document 二、熏蒸提取茚三酮比色法

8、127 HYPERLINK l bookmark148 o Current Document 第四节土壤微生物生物量磷分析129 HYPERLINK l bookmark150 o Current Document 一、熏蒸提取全磷测定法129第十七章土壤生物化学过程强度测定130 HYPERLINK l bookmark152 o Current Document 第一节土壤呼吸作用130 HYPERLINK l bookmark154 o Current Document 一、密闭静置培养测CO2法130 HYPERLINK l bookmark166 o Current Document

9、 二、通气培养测002法131 HYPERLINK l bookmark168 o Current Document 三、田间收集C02法132 HYPERLINK l bookmark170 o Current Document 第二节土壤氨化作用133 HYPERLINK l bookmark172 o Current Document 一、土壤培养法133 HYPERLINK l bookmark174 o Current Document 二、氨化菌培养液培养法134 HYPERLINK l bookmark176 o Current Document 第三节土壤硝化作用135 HYP

10、ERLINK l bookmark214 o Current Document 一、土壤培养法136 HYPERLINK l bookmark190 o Current Document 二、培养基接种土壤悬液法137 HYPERLINK l bookmark194 o Current Document 三、纯菌培养法138 HYPERLINK l bookmark196 o Current Document 四、环流法139 HYPERLINK l bookmark202 o Current Document 第四节土壤反硝化作用140 HYPERLINK l bookmark204 o C

11、urrent Document 一、硝酸盐消失法140 HYPERLINK l bookmark210 o Current Document 二、气相色谱法142 HYPERLINK l bookmark212 o Current Document 第五节土壤固氮作用145一、土壤培养测全氮法145 HYPERLINK l bookmark220 o Current Document 二、无氮培养液培养法146 HYPERLINK l bookmark224 o Current Document 三、乙炔还原法147 HYPERLINK l bookmark226 o Current Docu

12、ment 第六节土壤磷素的转化作用151 HYPERLINK l bookmark228 o Current Document 第十八章土壤酶活性测定152 HYPERLINK l bookmark230 o Current Document 第一节氧化还原酶153 HYPERLINK l bookmark232 o Current Document 一、脱氢酶153二、多酚氧化酶154 HYPERLINK l bookmark250 o Current Document 三、过氧化氢酶155 HYPERLINK l bookmark264 o Current Document 四、过氧化物酶

13、156 HYPERLINK l bookmark274 o Current Document 五、硝酸还原酶158 HYPERLINK l bookmark286 o Current Document 六、亚硝酸还原酶159 HYPERLINK l bookmark300 o Current Document 七、硫酸盐还原酶160 HYPERLINK l bookmark304 o Current Document 第二节水解酶161 HYPERLINK l bookmark306 o Current Document 一、脲酶161二、蛋白酶163 HYPERLINK l bookmark

14、322 o Current Document 三、a-淀粉酶和住淀粉酶164 HYPERLINK l bookmark330 o Current Document 四、脂肪酸165 HYPERLINK l bookmark332 o Current Document 五、转化酶（蔗糖酶）166第七章土壤微生物区系分析土壤是微生物生活的大本营，也是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤微生物区系（soilmicroflora）是指特定土壤生态系统中生活的微生物的数量和组成状况，是反映土壤微生物生态特征的重要指标。由于在不同的地理地带、不同的土壤类型、不同的季节和不同的土壤条件以及农业措施等影响下

15、，微生物的数量组成是不同的，因此，对了解不同土壤生态系统中微生物区系的动态变化及挖掘所需的土壤微生物资源，与对了解土壤基本理化性质一样，仍具有重要的现实意义。第一节一般土壤微生物的分离与计数从自然界或混有杂菌的培养体系中将所需要的微生物在培养基上形成单个菌落，称为菌种分离。分离土壤微生物的方法很多，但是所有的方法都有一定的局限性，因此也各有利弊.常用的有稀释平板法、MPN（mostProbablenumber）稀释法和土粒法。一、稀释平板法稀释平板法是测定土壤中活的微生物数量最常用的一种方法。该方法操作简便，而且可以同时从土壤中分离获取较多种类的微生物，井进行计数。（一）基本原理本方法是基于这

16、样的假设，即当已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生物与土粒分开，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌落可以很好地分散开来，以便于计数和移植。（二）操作步骤1）用1100感量的天秤称取10g土样加入盛有100mL无菌水的500mL三角瓶中。同时称取待测土样10llg（记下准确质量），经105（2烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，按下式计算土壤含水量的百分数。土壤含水量（）=（湿土重干土重）/湿土重*1002）将盛有10g土样和100mL

17、无菌水的三角瓶放在振荡机上振荡10min,使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。3）土壤分散后，吸取1mL土壤悬液到9mL稀释液中（或吸5mL到45mL稀释液中），依次按10倍法稀释，通常稀释到10-6。所用的吸管在每次吸取悬液时,在稀释中反复吸人吹出悬液35次,以减少因管壁吸附而造成的误差，并使悬液进一步分散。4）根据各类微生物在土壤中的数量多少选择经过适当稀释的悬液接种。一般真菌采用的稀释度为10-3一10-1，放线菌为10-510-3，细菌为10-610-4，每一稀释度必须重复35次，重复越多，越准确。5）土壤悬液接种刮刀法先于灭菌培养皿中倾注18mL左右选择性培养基，凝固后，用1mL

18、无菌吸管于瑚9表面加0.05mL（相当于1/20ml）或用无菌移液枪吸50UL一定稀释度的土壤悬液，然后立即用玻璃刮刀将悬液均匀地涂抹于琼脂表面。混菌法吸取1mL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷至45C的选择性培养基约15mL与培养皿中的土悬液充分混匀，待凝固后倒置保温培养。6）接种了土壤悬液的培养皿，待培养基凝固后倒置于2830C恒温箱中培养一定时间（细菌23天，真菌35天，放线茵57天）后取出，细菌和放线苗选取出现菌落数在20200的培养皿，真菌选菌落数在10100的培养皿，被扩散性细菌或真菌菌落占据琼脂表面15的培养皿应该剔除，因为它们抑制了其他菌落的正常发育，从而造

19、成试验误差。7）结果计算用刮刀法接种的计算方法：用混菌法接种的计算方法：通常以cfu（colonyformingunit）/g千土表示。（三）注意事项1）用同一支吸管接种同一样本不同稀释度的悬液于培养皿时，应从高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液。2）分离细菌时，为了避免由于某些细菌菌落扩散造成误差，倒皿时培养基温度不宜太高或待倒人的培养基凝固后，将培养皿微启，倒置于6070C烘箱中1520min,待琼脂表面冷凝水烘干或隔夜平板经检查确认无菌后，用同法涂抹土壤悬液。3）分离芽孢杆菌时,应事先将样品中无芽孢细菌杀死。所以要预先选取适当稀释度的土壤悬液于7580C水浴中煮15rain,然后再

20、按上述方法涂抹于琼脂表面。4）稀释平板法可因下列原因造成误差,因而对土壤中实际存在的微生物数量可能估计过低：土壤悬液中有的菌成群聚集在一起或附在土粒上未被分散，因此在乎板上形成的菌落数比实际菌数低；稀释液可能杀死某些微生物，有的抱子在这种条件下不Q9发芽，因而不能发育成肉眼可见的菌落；有的细胞在操作过程中被吸附在管壁上；培养基和培养条件有较高的选择性，以致相当一部分微生物不能正常发育形成苗落，5）稀释平板法并不是对所有的微生物类群都同样适用，一般来说这个方法最适用于苗体大小和重量都差不多的类群，如细菌和酵母。放线苗和真菌因菌体的不同部分的大小和质量相差较大，如菌丝、抱子和其他抱子器等质量大小均

21、有较大差异。严格来说，用此法所得菌落多数从抱子发育而来，而且与菌丝发育而成的菌落不能区分。6）用此法时干扰结果的因素较多，因此各个实验室对操作程序的每一细节都应有自己的规定，以便于结果之间的相互比较。二、MPN稀释法对具特殊生理功能的细菌，常采用稀释法计数，又称最大或然数法。如硝化菌、反硝化菌、厌氧固氮菌、硫化苗、反硫化菌、纤维素分解菌等。（一）基本原理本方法是基于选择适当稀释倍数的土壤悬液，接种在特定的液体培养基中培养，再检查培养液中是否有该生理类群微生物的生长。根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出每克土壤中某生理类群的微生物数量。（二）操作步骤1）土壤悬液制备方法同稀释平板法1

22、）一3）。2）根据微生物各类群在土壤中的大概数量选择5个相连的稀释度，将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中。每管接悬液ImL,每一稀释度重复5管（35管均可，重复越多，结果越准确），即一个样品每种培养基25管。3）于28C培养714天，根据各生理群的生长或反映，分别记载结果。4）根据各稀释系列试管中有无待测微生物生长或其生理反映的正负得出数量指标，并根据重复数量不同而在相应的稀释法测数统计表中查出细菌近似值。应用稀释计数法计数时，菌液稀释度要合适，要求在稀释系列中最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而必须最后一个最高稀释度所有重复都没有微生物生长。确定数量指标系取稀释系列中所有重复都有

23、生长（或呈正反应）的最高稀释度为数量指标的第一位数字。例如，稀释度10-110-210-210-4，10-5生长情况+-+重复数55420数量指标为542，由表查得近似值为25。如果在所有重复试管内都有微生物生长的稀释度之后仍有三个数字，则将最后二个数字加到前一个数字上。例如，稀释度10-110-210-310-410-5生长情况+-+重复数5则数量指标为542+2=5445）结果计算每克干土中菌数二设样品含水量为20，则干土为80每克干土中菌数=25*102*100/80三、土粒法对于在土壤中数量较少的某些微生物，有人采用将土粒直接按种在选择性培养基上的方法来分离计数。如好氧性自生固氮菌、纤

24、维素分解苗及其他种类的微生物等。（一）基本原理本法是把供试土壤颗粒，排列在适于某一生理类群微生物生长的选择性固体培养基上，这一类微生物的南落围绕着颗粒发育起来。由这些颗粒在试样中所占的百分数可以得到这类菌在土壤中的含量及其近似值。（二）操作步骤1）取少量土样加无菌水调成糊状。2）用粗细适当的圆头玻璃棒沾糊状土样，点在已凝固的选择性琼脂平板上。3）于28C培养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。即第二节厌氧微生物的分离厌氧微生物与好氧微生物的根本差别在于二者的呼吸机制不同。好氧微生物将氧作为生物氧化作用的最终受氢体，只有在有氧条件下才能生活。而厌氧微生物则只能在无氧条件下进行无氧呼吸，以

25、葡萄糖的氧化物作为受氢体，有氧时反而对其有毒害作用。因此，在分离和培养厌氧微生物时必须为其提供这两个条件。厌氧细菌的常用培养基见第四章第三节。这里介绍几种厌氧培养方法。一、充氮厌氧培养法（一）培养原理用真空泵抽去真空干燥器中的空气，用氮气、二氧化碳或氢气代替真空干燥器中培养严格厌氧细菌，可得表面茵落。（二）操作步骤1）将接种了不同稀释度土壤悬液的琼脂平板或试管置真空干燥器中，同时在干燥器中放人盛有美蓝氧化还原指示剂的试管（或小三角瓶），以检验干燥器内是否确为无氧状态，若美蓝指示剂为无色则表示已经无氧，如果指示剂呈盘色则表示仍有氧存在。2）在干燥器口加封闭油膏，盖紧，进行抽气和换气。将盛氮气或氢

26、气的钢瓶与真空干燥器及气体抽换装置连接（图7-1）。3）先将真空干燥器出口活塞2打开，关闭活塞3，打开活塞1，使真空干燥器、压力表、气候干燥塔与真空泵联通，然后进行抽气，使气压下降至002005个大气压时，先关闭活塞1，再停止抽气。4）小心转动活塞3或钢瓶减压阀，使氢气或氮气缓缓流经洗气瓶进入真空干燥器（注意放气勿过猛），充气到0.80.9个大气压，将活塞3或钢瓶减庄阀关闭，开动真空泵抽气，然后打开活塞1。抽气到002005个大气压后再行灌气。如此反复2或3次。5）最后一次将真空干燥器内气压加到略小于1个大气压。6）关闭真空干燥器活塞2。取下干燥器并用螺旋皮管夹将其管口夹紧，以免漏气。真空干燥

27、器置3CC恒温室培养1014天，待培养基表面长出单个菌落后，即可由真空干燥器取出培养皿，计算菌落数或挑菌移置斜面。二、焦性没食子酸吸氧法该方法利用焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收游离氧气，可创造厌氧条件。每克焦性没食子酸在过量碱液中能吸收100mL空气中的氧。其吸氧变化如下：（一）实验试剂美蓝氧化还原指示剂。介绍两种配方，第一种配方：A液：0.006mol/L氢氧化钠（NaOH）。B液：0.015美蓝溶液。C液：6葡萄糖溶液。以上三种溶液在使用时等量混合，加热使美蓝褪色，迅速放人厌氧培养容器中。第二种配方：A液；0.04%（m/v）美蓝，溶于O.2mol/L磷酸盐溶液（pH7.0）B液：0.5%

28、（m/V）抗坏血酸液ImL。C液：0.6%（m/v）琼脂8mL（琼脂用量还可减少），只要能够呈凝胶状即可。先加热琼脂溶液，然后加A液和B液于指形管（75mm*lmm）中，总量5mL。有氧时表面为蓝色圈，无氧时五色。不用时塞紧指型管，以免完全氧化。此管可反复使用。若蓝色延伸至1t2以上时，则要在沸水浴中使指示剂还原褪色后再用。（二）操作步骤于真空干燥器（或大试管）中，先加入焦性没食子酸若干克，即根据容器的体积按Is焦性没食子酸能吸收100mL空气中的氧来计算其应加入量，然后按焦性没食子酸与10%NaOH的比为1：10,加入相应体积的10%NaOH,立即将培养皿（或试管培养物）和加热褪色后的美蓝氧

29、化还原指示剂放人真空干燥器（或大试管）中，盖紧密封，以免漏气图72）。置30C恒温培养。其余步骤与上面叙述的相同。三、专性厌氧细菌的分离法在分离专性厌氧细菌时，要求将各操作过程尽可能少地接触空气，方法如下：（一）培养基的制备按分离的对象配制培养基，且培养基应除去其中的溶解氧，如图7-3所示，于调配过程不断通人经过高温炉去除了残余氧气的氮气。（二）培养基加入待分离悬浊液的方法配制后的培养基注人待测液时，仍要避免接触空气，如图74所示，边通氮气于盛有培养基的圆底烧瓶中，边用滴管（使用前进行干热灭菌，180C,30min）将培养基移人含有1mL适当稀释度待测悬液的试管中，在培养基移注过程中，该试管内

30、亦应不断通人氮气以驱除管内空气。移注后立即塞紧塞子，将管中内含物混匀，待琼脂凝固后置恒温室（30C）培养1014天，待管壁附着的琼脂上长出单个菌落后即行分离。（三）分离菌株于上述培养过程长出菌落的培养管中，边通入不含氧的氮气边用铂金丝挑菌，挑出的菌体立即接种在斜面培养基上。接种时，被移植的斜面琼脂管亦处在不断通氮气的情况下进行（图7-5）。移接后立即用橡皮塞密封斜面培养基试管，待长出菌苔后备用。第三节土壤主要类群微生物的分离与计数土壤微生物（soilmlcroorgamsm）是指生活在土壤中借用光学显微镜才能看到的徼/J、生物。它包括不同的类群微生物，如细菌、放线菌以及具有完善细胞核结构的真核

31、生物。它们是土壤物质生物转化过程的重要参与者，在土壤形成和发育、土壤肥力演变、养分有效化和有毒物质降解等方面起着重要作用。这里主要指土壤中的细菌、真菌和放线菌，也就是通常所说的土壤三大苗的分离与计数。一、好氧细菌的分离与计数细菌是土壤微生物中数量最多的一个类群。土壤细菌是一类单细胞、无完整细胞核的生物。它占土壤微生物总数的7090，在每克土壤中的细菌的数量可达几亿乃至百亿个。细菌菌体通常很小，直径为0、20、5口m，长度约几微米，因而土壤细菌生物量并不高。它们的种类和生理作用也极其复杂。一般情况下所分离得到的大多数细菌是腐生性的，在土壤有机碳氮转化过程中起着巨大作用。测定土壤细菌的数量通常采用

32、平板培养法。（一）培养基采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，又称营养琼脂培养基，一般认为这种培养基上发育的细菌数量最多。其具体配方参见“第四章第三节一、（一）。若分离芽孢杆菌，采用牛肉膏蛋白胨加麦芽汁琼脂培养基参见第四章第三节一、（一）。在这种培养基上芽抱杆菌的菌落不扩展，而且菌落特征比较典型和稳定，可以将土壤中常见的几种芽孢杆菌直接鉴别到种。当然，这必须要有足够的经验。（二）操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”。二、丝状真菌的分离与计数土壤真菌是指生活在土壤中菌体多呈分枝丝状菌丝体，少数菌丝不发达或缺乏菌丝的具真正细胞核的一类微生物，为化能有机营养型。土壤真菌数量约为每克土含2万10万个繁殖体，虽数

33、量比土壤细菌少，但由于真菌菌丝体长，真菌苗体远比细菌大。据测定，每克表土中真菌菌丝体长度lo100m，每公顷表土中真菌苗体质量可达5005000kg。真菌是参与土壤中有机质分解过程的主要成员之。它们能引起纤维素及其类似化合物的分解作用，同时也能分解含氮的蛋白质类化合物而释放出氨气。由于它们具有强盛的酶系统，分解复杂有机物质的能力特别强。因此，在没有开垦的土壤中，它们的数量并不比细菌少。丝状真菌数量的多少可反映土壤肥力及通气状况。测定土壤丝状真菌的数量一般也采用平板培养法。（一）培养基采用马丁氏（Martin）培养基，其具体配方参见“第四章第三节二、（一）”。为了抑制大部分细菌及放线菌的生长，1

34、000mL培养基溶液中应加1盂加拉红（roseBengal）水溶液3.3mL。临用时每100mL培养基中加1%链霉素液O3mL（30rogL）。（二）操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”。三、放线菌的分离与计数土壤放线菌是指生活于土壤中呈丝状单细胞、革兰氏阳性的原核微生物。放线菌在土壤中的分布也很广，其数量仅决于细菌，通常是细菌数量的1%10%，每克土壤中有10万个以上放线菌，占了土壤微生物总数的5%30%，其生物量与细菌接近。它们也积极参与土壤中不含氮及含氮有机化合物的分解作用。多种放线菌还能产生抗生素物质。因此，放线菌与土壤肥力以及有机质转化和植物病害防治有着更密切的关系，也是研究土壤微生

35、物不可忽视的一部分内容。土壤放线菌数量的测定一般也采用平板培养法。（一）培养基采用改良高氏I号培养基，其具体配方参见“第四章第三节四、（一）”。临用时在已熔化的高氏I号培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌和霉菌的生长。每300mL培养基中加3%重铬酸酸钾lmL（100mg/L）。（二）操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”。第四节土壤中功能微生物的测定土壤中存在著各种细菌生理群以及降解性微生物，其中主要的有纤维分解细菌、固氮细菌、氮化细菌、硝化细苗和反硝化细菌等。它们在土壤养分元素循环和污染物降解转化中起着重要作用。因此，分离和认识土壤中各种功能微生物对土壤微生物资源利用与开发具有重要意义。一、

36、氨化细菌的测定氮化细苗类群参与土壤中有机态氮转化为氨气的生物学过程，叫做氨化作用（ammonificafion）。由于这类细菌的活动，使植物不能利用的有机含氮化合物转化为可给态氮，为植物及一些自养和异养微生物繁殖与活动创造了良好的营养条件。因此，分析土壤中这类细菌的组成与数量是很必要的。（一）平板培养法1培养墓采用牛肉膏蛋白胨瑚S培养基，其具体配方参见“第四章第三节2操作步骤参见本章第一节“稀释平板法”，其上生长的好氧细菌，均属氨化细菌。1、蛋白胨氨化培养基（表7-1）培养基在普通滤纸上过滤，装入试管（1.8craXl8cra），每管装121C下灭菌30min。每个样品需培养基20支试管。表7

37、-1蛋白胨氮化培养基奈氏试剂：溶解2gKI于5mL蒸馏水中。在此溶液中加入Hgl2小粒至溶解饱和为止（32g）,将12.4gKOH溶于约40mL蒸馏水中。将此溶液倒人Hgl溶液中，加水至l00mL，操作步骤选取4个稀释度（如10-910-6）的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管（即4次重复），每管接种1mL。另取，4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28C条件下培养3天、5天后分别进行检查，根据培养基的混浊度、菌膜、沉淀、气味、颜色等变化来判断氨化细菌的有无（与对照管比较）。第七天用奈氏试剂定性测试有无氨的产生。从培养试管中吸取1或2滴培养液于白瓷板孔中，如加入1或2滴奈氏试剂后出现

38、棕红的或浅褐色沉淀，即表示培养基内有氨的产生。从测定记录结果，按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标和茵的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果。二、硝化细菌的测定土壤中的硝酸盐类的积累，主要是由氨化作用所产生的氨，通过硝化细菌的活动（硝化作用）氧化为硝酸，再与土壤中的金属离子作用形成硝酸盐。因此，土壤中硝化细菌的存在与活动，对于土壤肥力以及植物营养有着重要的意义。氨氧化为硝酸，是由两类细菌经过两个阶段完成的。第一阶段是氨氧化为亚硝酸，由亚硝酸细菌（氨氧化细菌）来完成；第二阶段是由亚硝酸氧化为硝酸，由硝酸细菌（亚硝酸氧化细菌）完成，两者统称为硝化细菌。土壤中硝化细菌数量的测定，一

39、般情况下只测定亚硝酸细菌的数量。因为土壤中，硝化作用的第一阶段和第二阶段是连续进行的。土壤中很少发现亚硝酸盐的积累。测定参与第一阶段的亚硝酸细菌的数量，即能说明硝化细菌数量的多少。（一）亚硝酸细菌数量的测定培养基采用改良的斯蒂芬森培养基，其具体配方参见第四章将培养基在普通滤纸上过滤，装入试管（1.8cm*18cm），每管装5mL，121C下灭菌30min。实验试剂格利斯试剂是由两种溶液组成：A液：将0.5g对氨基苯横酸加到150mL的20稀乙酸溶液中。B液：将1ga萘胺加到20mL蒸馏水和150mL20%的稀乙酸溶液中。3操作步骤选取6个稀释度（如10-710-2）的土壤悬液，每一稀释度的悬液

40、接种4支试管（即4次重复），每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28C条件下培养14天后，吸取培养液5滴于自瓷板孔中，加入1或2滴格利斯试剂，如有亚硝酸（NO2存在，则呈红色，表示有亚硝酸细菌存在。记录测试结果。按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果。如需对亚硝酸细菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的亚硝酸细菌培养液中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取浓缩10倍的该细菌培养液2mL,加人到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀，置于40C温箱中干燥至平板表面无积水，然后将经富集培养的样品进行悬液接种培

41、养。14天后可观察菌落的生长情况，然后制成涂片，经简单染色，在油镜下可见椭圆形或近于球形的菌体形态。（二）硝酸细菌数量的测定1培养基采用硝酸细菌培养基，其具体配方参见“第四章第三节五（八）”。将培养基在普通滤纸上过滤，装入试管（1.8em*l8em），每管装5mL，121C下灭菌30min。2.实验试剂格利斯试剂：同前。二苯胺试剂:将0.5S五色二苯胺（diphenylamine）溶于20mL蒸馏水及100mL浓硫酸中。操作步骤选取5个稀释度（如10-610-2”）的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管（即4次重复），每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28C条件下

42、培养14天后，测定硝酸根的产生。吸取培养液5滴于白瓷板孔中，先加入1或2滴格利斯试剂，如不呈红色，则表示亚硝酸已经完全消失。此时，另吸取培养液5滴于白瓷板孔中+加入1或2漓二苯胺试剂，如呈蓝色，则表示亚硝酸已氧化为硝酸（NO-）,说明有硝酸细菌的存在。记录测试结果。按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果。如需对硝化细菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的硝酸细菌培养液着中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取浓缩10倍的硝化细菌培养液2mL,加入到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀，置于40C温箱中干燥至平板表面无积水，然后将经

43、富集培养的样品进行悬液接种培养。14天后可观察菌落的生长情况。三、反硝化细菌的测定土壤中由于硝化作用所积累的硝酸，在厌氧条件下以no3或者no2代替O2作为最终电子受体，被反硝化细菌还原为亚硝酸、氨甚至氮气等，称为广义的反硝化作用。参与这一作用的细菌称为反硝化细菌（denitrifyingbacteria），也称为硝酸还原细菌。土壤中反硝化细菌多为兼性细菌，测定其数量一般采用稀释平板法。（一）培养基采用反硝化细菌培养基，其具体配方参见“第四章第三节五（九）”。每支试管（1.8cm*18cm）中装入10mL培养基（深层培养，以造成厌氧条件），在培养基中倒放人一小玻璃管（杜氏发酵管），121C下灭

44、菌30min。（二）实验试剂1）奈氏试剂：同前。2）格利斯试剂：同前。3）二苯胺试剂：同前。（三）操作步骤选取5个稀释度（如10-710-3）的土壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管（即4次重复），每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28C条件下培养14天后，检查是否有细菌生长。如有细菌生长，一般培养液变浊，甚至有时有气泡出现，吸取1或2滴培养液于白瓷板孔中，如加入1或2滴奈氏试剂后出现棕红色或浅褐色沉淀，即表示培养基内有氨产生，同时用格利斯试剂和二苯胺分别检查是否有亚硝酸和硝酸的存在。从测定记录结果，按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标和茵的近似值，参见本章

45、第一节“稀释平板法”计算结果。如需对反硝化细菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的反硝化细菌培养液中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取浓缩10倍的反硝化细菌培养液2mL,加入到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀，置于40C温箱中干燥至平板表面无积水，然后将经富集培养的样品进行悬液接种培养。14天后可观察茵落的生长情况，并纯化单菌落。如需镜检，可取无菌吸管1支，先用手指压紧管口，放人培养瓶底部，再松手，此时培养液会自动吸人，取出后涂片，经革兰氏染色后镜检，一般用酒石酸钾钠作为碳源的多为革兰氏阴性的细杆菌。四、好氧性自生固氮细菌的测定土壤中的自生固氮微生物，包括好氧性自生固氮菌和厌氧性

46、自生固氮菌、固氮藻类以及一些固定少量氮素的放线苗和真菌等，其中以好氧性自生固氮菌和厌氧性自生固氮菌的固氮能力较大，大气中的氮素占空气的70，但植物不能直接利用。固氮微生物却具有固定大气中氮素的能力，使气态氮素转变为植物可利用的形态，这对土壤氮索积累及植物氮素营养有重要意义。因此了解它们在土壤中的数量以及活动强度，对研究土壤氮素循环有十分重要的作用。（一）平板培养法1培养基采用瓦克斯曼77号培养基，或阿须贝无氮琼脂培养基，其具体配方参第四章第三节五”2操作步骤用上述培养基制成平板，每个土样准备培养皿9套。将稀释度（如10-310-1）的土壤悬液0.05mL,分别滴加到琼脂培养基的表面，用玻璃刮刀

47、刮匀后，于28C恒温箱中培养7天后，参见本章第一节“稀释平板法”计算结果。在此培养基上生长的自生固氮苗的菌落特征是：微微突起，表面光滑或具有皱纹，呈黏液状，有时还呈褐色，不透明，不染成红色，埋藏菌落呈三角形或菱形。镜检细胞肥大，常呈“8”字形，且具荚膜。必须与微嗜氮的微生物加以识别，并最好用化学方法测定其固氮量。(二)稀释法1.培养基采用阿须贝氏培养基，但不加琼脂，其具体配方参见“第四章第三节五.(一)。将5mL培养基分装于(1.8craX18cra)试管中，管中贴于内壁放一滤纸条，一半浸入培养基内，一半露于空气中，121C下灭菌30min.2.操作步骤选取4个稀释度(如10-410-1)的土

48、壤悬液，每一稀释度的悬液接种4支试管(即4次重复)，每管接种1mL。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28C条件下培养7天后，如滤纸上出现褐色菌落，则表示有自生固氮菌的生长。按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“稀释平板法”计算结果。如需对好氧性自生固氮菌进一步分离与纯化，可吸取1mL培养物加入新鲜的固氮菌培养液中再培养，必要时可反复两次进行富集培养。吸取该培养液0.05ml,加入到平板上，涂匀，置于28C温箱中培养7天后观察菌落的生长情况，并纯化单菌落。十一、纤维分解菌的测定纤维素(cellulose)是组成植物组织的主要成分，约占植物组织的的

49、。土壤中植物残体的分解主要是由微生物来进行的，是土壤碳素循环的重要驱动者。纤维素分解菌有好氧与厌氧之分，土壤中纤维素的分解作用主要是由好氧性分解菌进行的，如噬纤维素菌属(Cytophaga)，具有很强的纤维素分解能力。除细菌外，真菌与放线菌的某些类群也具有分解纤维素的能力。在厌氧条件下，分解纤维素的微生物是由一些产抱子杆菌，如奥氏纤维素芽抱杆菌(Bacillusomelianskii)和相类似的少数种进行的。它们不但枉大气碳素循环中有重要作用，而且其分布与土壤性状、土壤肥力有着密切的关系。因此，测定土壤中纤维素分解菌的数量是十分必要的。（一）好氧性纤维素分解菌1、平板法1）培养基米用赫奇逊培养

50、基，集体培养参见“第四章第二节五（五）。（2）操作步骤分别接种0.05mL稀释度为10-310-1的土壤悬液于冷凝的平板培养基上,用玻璃刮刀使其均匀涂抹于培养基的表面。然后用灭菌的镊子夹取灭过菌的直径与培养皿等大的滤纸,覆盖于培养基上,再用干净灭菌的玻璃刮刀压平,置于盛有水的干燥器中,28条件下保湿培养14天后取出，计算黏液菌、弧菌、真菌和放线菌的数量。参见本章第一节“稀释平板法”计算结果。如需对好氧性纤维素分解菌进一步分离与纯化，可米用划线法纯化单菌落。2稀释法（1）培养基采用赫奇逊培养基，不加琼脂，其具体配参见“第四章第三节五（五），。将5mL培养基分装于试管（1.80nXl8em）中，管

51、中贴于内壁放一滤纸条，半浸入培养）R内，一半露于空气中，121C下灭菌30min。滤纸条是以普通的滤纸剪成5cmXO.7em的纸条。如呈酸性反应，先以碱性溶液（在自来水中加入1或2滴浓碱液即可），浸泡45h，取出用自来水冲洗,烘于使用。（2）操作步骤用5个稀释度（10-510-1）的土壤悬液接种，每管接土壤悬液LOmL，每个稀释度的悬液重复4管。另取4支培养基不接种悬液丽接种无菌水作对照。在接人土壤稀释液时，需经过露于液面的滤纸条流人培养基中。于280条件下培养14天，检查各试管中滤纸条上细菌苗落的出现及滤纸变薄、断裂、色素产生情况。从测定记录结果，按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标

52、和茵的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果，（二）厌氧性纤维素分解菌（1）培养基采用厌氧性纤维索分解菌培养基，其具体配方参见“第四章第三节五*（六）”。将上述培养基1015mL装于试管中，并插入lcmXlOcm滤纸条一片或加入切成2mmX2mm大小滤纸片005g，121C下灭菌30min。（2）操作步骤用5个稀释度（1010）的土壤悬液接种，每管接土壤悬液1.OmL,每个稀释度重复4管。另取4支培养基不接种悬液而接种无菌水作对照。于28C条件下培养14天后（加滤纸小片者放一个月），取出检查滤纸上的溶解区以及菌落或色斑情况，以判别有无厌氧分解菌。加滤纸片者培养一个月后取出振荡观察纸屑腐

53、烂情况。从测定记录结果，按附录中稀释法四次重复测数统计表得出数量指标和菌的近似值，参见本章第一节“MPN稀释法”计算结果。如需继续分离纯化，可用纤维素琼脂培养基，稀释平板法接种，经厌氧培养，可得到厌氧性纤维分解菌的纯培养物。十二、光合细菌的测定光合细菌是一大类具有光合色素，能在厌氧、光照条件下进行光合作用的原核生物的总称，一般生长在湖底土、河流底土、海底土和水稻土等生境中。光合细菌由四个科组成：着色菌科（红硫菌科，又称红色或紫色硫细菌）；绿菌科（又称绿硫细菌）；红螺菌科（又称红色或紫色非硫细菌）；绿色屈挠菌科（又称滑行丝状绿色硫细菌）。前两个科的光合细菌均为厌氧光台细菌，但着色菌科细菌的硫磺颗

54、粒在细胞内，而绿菌科细菌的硫磺颗粒却在胞外，两者都能以C02作为唯一或主要的碳源，以H2S作为光合反应的供氢体，能源来自日光，属光能无机自养型，后两科的光合细菌都能利用各种有机碳化合物为碳源和光合反应的供氢体，能源来自日光，属光能有机异养型。其中，红螺菌科细苗在有机污水治理、光合细菌饲料蛋白、天然色素以及光合细菌产氢等方面具有广泛的应用前景。因此，本节将介绍土壤中光合细菌的分离、纯化常见方法。（一）培养基（表73）7-3光合细菌培养基（二）操作步骤称取60g适于光合细菌生长的土壤，灭菌后装入玻璃量筒内，再加入采集的样品水。根据欲分离的不同光合细菌选用上述相同的培养基100200mL，并与土壤搅

55、拌均匀，然后加流体石蜡（由液体石蜡和固体石蜡以1：1比例加热混合而成）隔绝空气，造成厌氧环境。在2535C温度下，用5000100001x的光照强度进行光照培养28周。这时，光合细菌在玻璃壁上呈菌落状，布满整个筒壁，呈红色或绿色。然后，用吸管在细菌生长良好的泥土层吸取泥水样和细菌，移植至约50mL的试剂瓶中，再加入上述培养液，继续培养。用试剂瓶培养时，先装入泥状溶液，再把各种培养液装满瓶子，然后塞紧塞于，防止培养液溢出，保持厌氧条件。试验瓶的橡皮塞用胶布封好，以防止长时间培养液蒸发。在这个试剂瓶中不断进行富集培养，并将生长良好的光合细菌悬浮液适当稀释，在厌氧条件下继续进行光照培养。用碱性没食子

56、酸法进行厌氧平板培养，在g00050001x光照条件下进行。把干燥器内的空气用真空泵减压到3，再通人无菌的氢气，进行气体置换造成厌氧条件，然后用碱性没食子酸把残余的氧气除去把悬液和琼脂培养基混匀后装入已灭菌的细玻璃管中凝固，把玻璃管口两端用橡皮塞塞紧后进行光照培养。培养结束后，在无菌条件下推出凝固琼脂，或打碎玻璃管。将以上分离到的不同形态的菌株进行反复分离纯化，直到在显微镜下观察菌体形态基本一致，纯化工作才结束。菌株供鉴定用。十三、甲烷产生菌的测定大气甲烷是引起全球气候变暖的主要因素之一。大气中的甲烷/L乎有一半来自于富含有机物的缺氧、多水的水田土壤、沼泽、湿地、水底淤泥等厌氧生境的生物过程。

57、这些甲烷在厌氧生境中由产甲烷细菌（methanebacteria）形成以后，经土壤和水层逸散人大气。因此，甲烷产生菌对自然界碳素循环起着重要作用。（一）培养基（表74）（二）操作步骤将熔化好装有固体培养基的培养管，放置排列于水温在4550C的水浴锅中，每一富集培养处理，排列7或8支，每列前放一支同样组分，仅缺少琼脂的液体培养基，每处理重复1次。每支培养管5mL培养液中，用lmL注射器分别加入1%硫化钠和5%碳酸氢钠混合试剂、青霉素液各o.1mL。把相应基质的富集培养物在旋涡混合器上将富集絮状物打散。用lmL灭菌注射器以氮气流洗去氧后，吸取0.1mL富集培养物，迅速注入加有同一基质的液体培养基中

58、，此管立即在旋涡混合g9上混匀，然后依次同法稀释，每次稀释后均匀混合。稀释程度视富集培养物中产生甲烷细菌的数量而定，以最后2或3个稀释度的培养管中出现10个以下单菌落为宜。在滚管机水槽中加入冰块和冷水，使滚管过程中水温保持较低温度，以便培养管中琼脂培养基迅速凝固。启动滚管机，把巳接入的富集培养物琼脂培养基的培养管平稳放在滚轴与支托点之间，任意均匀转动。待琼脂培养基在培养管内壁凝固成为均匀透明的琼脂薄膜为止。如无滚管机也可在一瓷盘中加水、冰块和少量氯化钠以降低温度，用手滚动进行。30C培养培养10天后，以厌氧操作技术挑取滚管菌落，培养后再进行厌氧滚管分离，多次反复直至纯培养物。得到多株纯培养物，

59、采用气相色谱仪检测是否能利用甲烷，并进行荧光显微镜检。十四、有机污染物降解菌的测定土壤中存在大量的微生物资源，它们是土壤环境的净化器，对土壤环境修复发挥着不可替代的作用。因此，土壤中降解菌资源的筛选与分离成为土壤环境微生物修复研究中的重要工作。因此，本节以有机污染物（农药、酚、石油、多环芳烃及有机氯化合物等）为例，介绍土壤中商效降解菌的筛选、分离及纯化常规方法。（一）培养基无机盐含有机污染物培养基（表75）（二）操作步骤称取2s有机污染土壤（也可从非污染土壤中筛选），接种于新鲜的100mL液体无机盐含相应有机污染物的培养基中，在30C，150r/rain摇床振蔼培养35天后，吸取lmL转接至新

60、鲜的上述培养基（必要时，有机污染物浓度也可逐一增加），连续富集，每周转接1次，多次转接后，用稀释平板分离法在富集培养基上分离，反复划线分离得到菌株。所得菌株重新转接至含有机污染物的无机盐固体培养基上，以验证菌株的降解能力。观察记录菌种的生长状况、菌落特征、镜检菌体的形态结构，以及生理生化和生态特征，革兰氏染色、芽孢染色及鞭毛染色以及菌种鉴定。十五、重金属抗性菌的测定土壤微生物可以积累和转化环境中的重金屑，其中，生物积累机理主要表现在胞外络合作用、胞外沉淀作用以及胞内积累三种作用方式。由于微生物对重金属具有很强的亲和吸附性能，有毒金属离子可以沉积在细胞的不同部位或结合到胞外纂质上，或被轻度整合在