载体选择和构建

1、关于载体的选择与构建第一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月主要内容1.细菌质粒载体2.噬菌体载体3.酵母细胞载体及大容量载体4.动、植物载体第二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月基因工程载体： 携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具。载体的一般特性：在宿主中能自我复制或借助宿主染色体进行复制容易从宿主细胞中分离纯化具有容纳外源DNA分子的能力有限制性内切酶位点，便于基因组装有对载体进行筛选的标记或报告基因第三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.1 质粒的定义质粒是染杂色体外能进行自主复制的遗传单位，由J.莱德伯格在1952年提出。共生

2、生物、真核生物的细胞器DNA和细菌染色体以外的单纯的DNA分子某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。 1. 质粒载体1.2 质粒的分类1.2.1 按照复制性质： 严紧型质粒:带有与分配有关的基因，由DNA聚合酶复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，12个/细胞； 松弛型质粒:由DNA聚合酶复制，当染色体复制停止后仍然能继续复制，数十数百个/细胞一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，例如某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

3、第四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.2.2 按照构型： 环形双链DNA分子 共价闭合环状：两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型 开环DNA：一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口 线状DNA：这种质粒的双链断裂，由环状变为呈线状这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，超螺旋构型最快，其次是线性构型，开环构型最慢。 线性质粒 发卡线性质粒：在两端均有反向重复序列，形成共价闭合的发卡环 多肽结合质粒：5端与多肽连接，同时两末端还具有反向重复序列，多为放线菌质粒这些结构可以防止质粒被降解1.2.3 按照接合能力: 接合型质粒（F质粒） 非

4、接合型质粒 第五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.2.4 按照宿主范围: 广宿主质粒（以及穿梭质粒） 单一宿主质粒 1.2.5 按照宿主中的存在形式: 游离型质粒 整合型质粒（复制子不能被宿主识别，带有同源片段） 1.2.6 按照功能： 基因克隆质粒（筛选系统，MCS） 基因表达质粒(筛选系统，MCS，启动子，RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶） 第六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.3 质粒的复制1.3.1 复制子(replicon)包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗

5、传单元 质粒一般只带有少量复制需要的基因，其它由宿主提供。 广宿主质粒一般携带复制所需的所有或大部分基因，而且启动子、RBS位点都可以被多种宿主识别。 质粒中除了复制子之外的序列都不是必须序列，可以用其它序列替换来进行基因克隆或表达。pMB1, colE1 replicon 拷贝数1520 宿主范围小：肠细菌修饰的pMB1 replicon 拷贝数500700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列)pSC101 replicon 拷贝数5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌pUB110 50 广 多种革兰氏阳性菌pE194 5 广 多种革兰氏阳性菌第七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.3.

6、2 拷贝数控制机理反义RNA对拷贝数的调控colE1 repliconRNAII被RNaseH切割后充当复制引物链（前导链的引物），而RNAI与其结合后阻止RNaseH的切割质粒编码的Rop蛋白二聚体可提高两种RNA结合复合物的稳定性质粒拷贝数越高， Rop、 RNAI浓度越大，最终终止复制细胞分裂后，Rop及RNAI浓度变小，开始进行复制第八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月RepA 调控Iterons are directly repeated sequences（1722bp) which play an important role in regulation of pla

7、smid copy number in bacterial cells （重复子）Ori附近的repA基因编码RepA蛋白，其对自身的表达具有负调节作用RepA蛋白可以和Iterons结合，促进复制复合物的形成，从而开始质粒的复制质粒拷贝数高时， RepA蛋白浓度高，形成二聚体，两个质粒聚集连在一起，复制停止。细胞分裂后重新复制pSC101 replicon第九张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.4 质粒的不稳定性 分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DN拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体； 结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失

8、 质粒的分配方式：主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定性随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使含质粒细胞比例越来越少 第十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月第十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月质粒上的par区段编码分配蛋白，质粒上还有par蛋白的结合序列（inc区）负超螺旋密度的增加可以使质粒分配更稳定，par 区可以增加负超螺旋密度，DNA促旋酶则降低分配稳定性。(partition re

9、gion）第十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月质粒多聚体也导致分配不稳定： 质粒多聚体含有多个复制起点，其复制速度是单体的数倍，将导致大量细胞只含有多聚体质粒而影响分配稳定性有的质粒具有宿主致死功能，杀死丢失质粒的细胞，如F质粒的ccdA(编码解毒剂）,ccdB（编码毒性蛋白）第十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月 用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在同一个细胞中不能和平共处。这种现象称之为不相容性1.5 质粒的不相容性若两种质粒拷贝数不一样，分配有利于高拷贝数质粒不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有

10、相同的复制子 第十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月 细菌种类 质粒不相容群 代表性质粒 革兰氏阴性细菌IncFF, R386, R455, ColVIncFR1, R100IncFCol1B-K98IncFR124IncARA1IncCR40a, R55IncHR27, R726IncIColIb-P9, R144, R483, R64, R621aIncMR69, R466bIncNR46, R15, N3, pKM101IncOR16, R723IncPRP1, RP4, R68, R751, R690, RK2IncQRSF1010, pKT212, pKT230, pG

11、SSIncWR7K, R388, pSA747IncXR6K 革兰氏阳性细菌pT181pT181, pC221, pS194, pC223, pUB112, pE194pUB110pBC110, pBC16pSN2pSN2, pE12, pIM13第十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（1）型复制 单向复制 双向复制革兰氏阴性细菌中多数质粒是以型方式复制，R1，R100等是单向复制，F，R6k等是双向复制类型。1.6 质粒的复制方式第十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制，如pC194, pE194等，这种方式会造成质粒结构

12、的不稳定，存在大量的单链质粒DNA（2）滚环复制 第十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移。质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒被称为自主转移质粒(self-transmissible plasmid)或接合质粒(conjugative plasmid)。有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmid)，可以借助这种方式将重组质粒导

13、入难于转化的宿主中。1.7 质粒的转移性第十八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月质粒拷贝数转移性质粒拷贝数转移性ColE110-18不能R6k1-2能ColE210-18不能RP44-7能ColE310-18不能pBR322约20不能F 因子1-2能pBR325约20不能R1001-2能E.coli 质粒的转移性第十九张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月 G-菌中质粒分子量较大，而G+菌中质粒较小； 已知大肠杆菌的F质粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、 R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒也有38kb。 G+细菌如链

14、霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。 自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同，G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒分子量较小。（1）自主转移质粒的特点第二十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒自主转移过程中起着重要作用。 自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点的非自主转移质粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染色体上后，带动染色体转移也是从质粒的oriT位点开始的。 tra基因：大多数tra基因的产物与性菌毛的形成(F、RP

15、4和pKMl01都编码一根性菌毛)、杂交对的形成有关；有些tra基因编码作用于oriT位点的内切酶，使质粒中的一条DNA链产生切口，从而开始转移；有些tra基因则与质粒转移调控等有关。 oriT位点：oriT位点不仅是质粒转移的起始位点，也是质粒转移后DNA末端再环化的位点，因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移。第二十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（2） 可移动质粒的特点 不能在菌株间形成接合通道：G-细菌中可移动质粒缺少与性菌毛合成有关的基因(约10个左右) 。因此，在进行转移时，必须利用位于同一细胞内的自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。具有特殊的转移起始位点和

16、切割功能基因：如ColEl具有独特的bom位点和负责DNA转移的mob基因。ColEl的bom位点类似于F质粒的oriT。mob基因的功能类似于tra基因，mob基因也能编码特异的核酸内切酶，在bom位点进行切割，但没有编码性菌毛的tra基因，所以它不能自主转移。第二十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月F质粒诱动ColEl转移的模型图 mob产物bomF- mobF+ mob bomF+ mob-F+ mob+ bom-不能转移性菌毛转移不能转移不能转移F质粒第二十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.8 报告基因抗生素抗性基因： kan, cat, bla, sp

17、c, em, tet 等组织化学显色基因： E. coli lacZ ， -galactosidase（半乳糖苷酶） E. coli gusA（uidA) ， -glucuronidase (GUS，葡萄糖苷醛酸酶）荧光蛋白基因： rfp，gfp，.荧光素酶基因：luc 荧光素酶在氧化底物荧光素（luciferin）的过程中，会发出生物荧光，可以通过荧光测定仪或液闪仪测定荧光强度。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 报告基因：是为基因表达强度、蛋白定位等提供可测信号的一类基因。标记基因：为重组提供筛选标记的一类基因第二十四张，PP

18、T共一百三十五页，创作于2022年6月蓝白斑筛选(互补筛选）原理 载体携带大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸（ N端，称为肽）的编码信息。宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸（met), 导致翻译在后续met处开始，其产物为-半乳糖苷酶的C端，称为肽） 肽段无催化能力，但可使肽段正确折叠并形成稳定的四聚体；肽段单独无法正确折叠，因此两个肽段在一起才具有催化活性，这称为互补。 载体的肽编码序列中还插入一个不破坏阅读框的多克隆位点（MCS）， 由MCS编码的少数十几个氨基酸插入到肽的氨基端不会影响其功能，然而，当外源DNA插入MCS后，几乎不可避免地导致其功能丧失。空载

19、体进入宿主后在IPTG诱导下实现互补， -半乳糖苷酶分解X-Gal产生蓝色物质，菌落为蓝色；连接有插入片段的载体在IPTG诱导下无互补作用， X-Gal不被分解，菌落为白色X-Gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷IPTG: 异丙基-D-硫代半乳糖苷 X-Gluc ： 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷MCSPlac第二十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月X-galBlueX-galNo insertInsertX-galBlueX-galNo colorNo insertInsert第二十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.9 质粒的提取（1） C

20、sCl-EtBr密度梯度离心(Radloff,1967)溴化乙锭掺入DNA导致密度降低线性DNA和闭环DNA结合的溴化乙锭的量有差异，前者掺入的更多质粒纯度非常高，但耗时、仪器药品昂贵 36万g :6h 18万g:48h 温和裂解细胞，释放出质粒，而染色体、蛋白及细胞残余通过离心除去第二十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（2） 碱裂解法（Birnboim and Doly，1979）线性DNA在pH1212.6易变性，变性后不易复性而环状DNA不易变性，即使有部分发生变性也容易复性溶液I: 50 mM葡萄糖（使菌体均匀悬浮，不易沉积结块） 25 mM Tris-Cl，pH 8.

21、0； （缓冲作用） 10 mM EDTA （螯合Mg2+等金属离子，失活DNase)25：24：1 酚/氯仿/异戊醇：（变性蛋白质）溶液II: 0.2 N NaOH (裂解细胞、线性DNA变性) 1% SDS(与蛋白质结合）溶液III: 3 M 醋酸钾( 置换SDS的钠离子，形成沉淀，并与基因组DNA 共沉淀） 2 M 醋酸（中和碱性pH，防止DNA断裂）无水乙醇：沉淀质粒DNA第二十八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液第二十九张，PPT共一百三十五页，创作于2022

22、年6月染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时（40-50s)，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。（3）煮沸法原理第三十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1.10 质粒的改造对天然质粒的改造，原则上仅需要保留其复制子的必需序列和标记基因。尽可能减少分子量，小质粒在提取纯化时不易破坏，可容纳更大的外源DNA。加入多克隆位点（MCS),便

23、于在此处插入各种片段有1-2个可在宿主中表达的标记基因若改造成表达质粒，还需要加入启动子、RBS等元件。多克隆位点：人工合成的，密集排列的，可被多种限制酶识别切割的DNA序列第三十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月克隆片段一般插入Ap或Tc中，破坏一个抗性基因正选择方法：分别在含有Ap或Tc的平板上对应点接培养菌株负选择方法：对于Ap, 选择培养基中含有淀粉，长出大菌落后倒入含有青霉素和碘的指示剂， Ap抗性菌株将青霉素转化为青霉酮酸，后者和碘结合，四周不会变蓝，而Ap敏感株为蓝色。对于Tc，采用环丝氨酸富集法。抗性株能合成蛋白质，死亡；敏感株不能合成，生长受到抑制pBR322分

24、子量小，合适的标记，拷贝数较多blatet克隆载体和表达载体示例第三十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月pUCFrom pMB1分子量小合适的标记拷贝数多第三十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月第三十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月主要内容1.细菌质粒载体 定义，分类，复制机理与方式，不稳定性与不相容性，可移动性 报告基因，质粒提取方法与原理2.噬菌体载体3.酵母细胞载体及大容量载体4.动、植物载体第三十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2. 噬菌体和噬菌体载体 1951年，J. Lederberg的妻子Esther Lederberg

25、证明了J. Lederberg和Tatum用来杂交的K12中有原噬菌体，并命名为，经过约10年的研究搞清了溶源化的实质。 噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 噬菌体基因组为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp。其两端的 5 末端带有 12 个碱基的互补单链（粘性末端），称为 COS 位点；2.1 噬菌体及其生活周期Cohesive end site第三十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月 噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。用感染大肠杆菌的噬菌体改造成的载体是应用

26、最为广泛的病毒载体。T偶系列烈性噬菌体 温和噬菌体（ ）第三十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月晚期基因第三十八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月噬菌体生活周期可选择进入裂解生长状态（lytic growth），大量复制并组装成子代 噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）；或者进入溶源状态（lysogenic state），将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。 第三十九张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月当噬菌体侵入新的

27、宿主细胞时，裂解和溶原途径以同样的方式开始。二者都需要前早期和后早期基因的表达。但是以后它们就分道扬镳了：如果晚期基因表达了，随之而来的是裂解发育；如果建立起阻遏蛋白cI的大量合成，接着发生的则是溶原化N 基因：编码一个抗终止(Antitermination)因子，该因子作用在nut位点，允许转录继续进入后早期基因。cro 基因：有双重功能a.阻止阻遏蛋白CI的合成(如果裂解周期继续进行，这种作用是必须的)；b.关闭前早期基因的表达(在裂解周期后期是不需要的)。（1）前早期基因表达第四十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月后早期基因包括阻遏蛋白基因cI,两个复制基因(裂解侵染所必须)

28、，和7 个重组基因(某些与裂解侵染时的重组有关，有两个是溶源时将DNA 整合到细菌染色体中所必需)，还有3 个编码调控产物的基因，其调控产物有相反的功能： c和c这对调控产物是启动阻遏蛋白CI合成所必需的。（有利溶源） 调控蛋白Q 是一个使宿主RNA 聚合酶继续进入晚期基因的抗终止因子(有利裂解）（2）后早期基因表达（3）晚期基因表达晚期基因是作为单独的转录单位表达的，它从位于Q 与S 之间的启动子PR处起始。 PR 是组成型的, 在缺乏基因Q 产物时，转录终止在tR3部位。产生的转录物称为6S RNA，长194 个碱基;当存在可利用的pQ 时，pQ 抑制在tR3处的终止作用，使6S RNA

29、延伸，其结果使晚期基因全部表达。第四十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（4）cI在溶原化中的作用 c基因是从启动子PRM处转录，转录在该基因的左方停止。由于转录本缺少常见的核糖体结合位点，所以转译效率较差，只产生低含量的阻遏蛋白，此时以单体形式存在。 c浓度高时形成二聚体，可独立地与两个操纵基因OL和OR结合： 1区比2、3区与c的亲和力高约10倍，c总是先与1区结合。1区被二聚体结合后增加第二个二聚体与2区的亲和力。当1 与2区 都被结合时，这种相互作用不再扩大到3区在1、2区的结合阻止启动子PR、PL的启动,同时激活细菌RNA聚合酶在PRM的转录，建立了一个正的自调控回路。

30、阻遏蛋白的浓度变得过大时将占有OR3区， PRM的启动被阻止， c的转录终止，从而降低阻遏蛋白浓度。自体正负调控系统第四十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月只要阻遏蛋白c的含量充分，c基因就持续表达。结果是OL和OR无限期被占用，于是就阻遏了裂解周期，使原噬菌体维持其惰性形式。阻遏蛋白的存在解释了超感染免疫性现象。如果有第二个噬菌体DNA 进入溶原细胞，由原噬菌体基因合成的c将立即与新噬菌体的OL和OR结合，阻止第二个噬菌体进入裂解周期。cI基因区段也称为免疫区，表示为imm。cI在溶原化中的作用人工改造的温敏性启动子系统：cITS857+(PL或PR), 42时阻遏蛋白失活，启

31、动转录；反之31 时无法转录第四十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（5） CII和Cro的作用当DNA 进入新的宿主细胞时，细菌的RNA 聚合酶不能转录c，基因N和cro首先被转录。接着，pN使c、 c、Q和其它后早期基因转录。C蛋白激活PRE （在cro和c之间）、PI(插入基因int的启动子）及Panti-Q(位于Q基因内)的转录：Cro 蛋白（二聚体）通过与PRM 作用直接阻止阻遏蛋白的合成，并可关闭早期基因的表达，间接阻止阻遏蛋白的合成。PRE的启动产生了cro反义转录本及cI转录本，导致前者表达终止和最初CI蛋白的合成， CI蛋白启动正自调控系统并终止早期基因转录。此

32、后胞内已合成的CII及CIII迅速被降解（C在体内极端不稳定，因为有一种HflA 的宿主蛋白质使它降解。C的作用是保护C抗拒这种降解）。Int基因产物使DNA 整合到宿主染色体上而溶原化Panti-Q的启动产生了Q反义转录本，终止了裂解所需晚期基因的表达Cro 对OR 3 的亲和力比对OR 2和OR 1的亲和力更强，它首先与3区结合。这个结合抑制了RNA 聚合酶与PRM的结合，破坏了溶原维持的正负自调控系统Cro结合在1区或2区（约比CI与该区亲和力低8倍）降低PL和PR的转录水平，降低早期基因(包括Cro 自身)的表达水平Hfl：高频溶源化， high frequency of lysoge

33、nization 第四十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月它们之间的区别可归结为：究竟是阻遏蛋白CI还是Cro 将获得两个操纵基因的占用权。（6） 溶原化还是裂解？建立溶原的起始活动是CI 在OL1 和OR1处的结合。第一个位点的结合将使另一个阻遏蛋白二聚体在OL2 和OR2 处的协同结合快速成功。这终止了Cro的表达及Cro与3区的结合机会，并开始经由PRM进行阻遏蛋白的合成。进入裂解周期的起始活动是Cro在OR3处结合，阻止了溶原维持回路在PRM处的开始。接着，Cro必须与OR 2或OR 1，以及OL 2 或OL 1 结合，以降低早期基因的表达来停止合成C和C，已合成的 C和

34、C被降解，导致CI无法继续合成。最初被合成的Q蛋白导致晚期基因表达（噬菌体外壳）细菌生长在丰富的培养基时蛋白酶活性强， C和C不能稳定存在，所以噬菌体倾向于裂解；当细胞饥饿时，它更倾向于进入溶原(C和C较稳定)。当溶源菌受紫外线或丝裂霉素C处理后，会发生SOS反应，激活RecA蛋白，使C蛋白分解，可以进入裂解期第四十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月第四十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月int：整合酶基因， 识别宿主细胞染色体DNA和噬菌体DNA上的att位点（PP与BB) ，并能催化二者的断裂和再连接。att：附着位点，在宿主细胞DNA上称为attB，在噬菌体D

35、NA上称为attP，两者含有一段15bp的同源序列，重组酶可识别该序列而使噬菌体基因组插入到宿主的染色体DNA上。xis：切除酶基因。 int和xis基因产物共同作用，能使att位点发生重组（PB与BP)，并将原噬菌体基因组DNA从宿主染色体中切割下来，使噬菌体进入裂解过程。整合和切割都需要来自宿主的一种整合因子Hif协助（7） 噬菌体的整合与割离第四十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月Holliday连接结构第四十八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2.2 噬菌体载体有长度限制:(75%-105%)48kb才能被有效包装入蛋白外壳并形成清晰的噬菌斑，必需区长28Kb

36、有相当长的感染非必需序列，这些序列可以删除，或用填补序列取代（保证总长75%），75%长度的限制也提供了一种正筛选方法）限制性酶切位点过多可插入的长片段DNA（长至20kb以上），且包装的噬菌体感染大肠杆菌比质粒转化细菌的效率高得多，冻藏后存活率高，非常适合于构建cDNA文库或基因组文库。克隆操作要比质粒载体复杂 2.2.1 野生型 噬菌体载体的一般特点2.2.2 噬菌体载体的改造删除多余限制性内切酶位点中段非必需区被替换为某些报告基因或其它正筛选系统，以及和多克隆位点等 第四十九张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2.2.3 噬菌体载体的类型插入型载体（如gt10等 )替换型载体（

37、如EMBL3等）插入型载体只能承受较小分子量（一般10kb）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA空载体形成蓝色噬菌斑，插入片段载体形成无色噬菌斑空载体形成浑浊的噬菌斑，插入片段载体形成清晰的噬菌斑Charon vector 卡隆载体 第五十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月Spi 筛选 gam筛选 2.2.4 其他筛选系统 野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ （sensitive to P2 i

38、nterference）。 如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，并形成微小的噬菌斑，即Spi- 。 通过对噬菌体载体 DNA 上的 red 和 gam 基因的缺失或替换，可 在P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。 只有晚期的滚环复制所形成的线性多聚体DNA能被有效包装，gam基因是控制噬菌体从早期的双向复制模式向晚期的滚环复制模式进行转换的开关，因此gam-则不能大量形成线性多聚体DNA，只能靠red或宿主的rec重组系统将环状DNA重组成多聚体（需要chi位点才能高效重组），然后包装成噬菌体颗粒，形成微小的噬

39、菌斑（没有chi位点, crossover hot-spot instigator交换热点激活区， 只能形成极其微小的噬菌斑）. gam+的噬菌体可以形成清晰的大斑。第五十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2.2.5 噬菌体载体克隆一般过程第五十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2.2.6 噬菌体载体的体外包装如果用DNA直接转染感受态细胞，效率较低:105个噬菌斑/g DNA用载体与外源片段连接后的产物转染：104103个噬菌斑/g DNA如果包装成噬菌体颗粒感染感受态细胞，则效率很高：高达107 /g DNA，每个颗粒转导效率几乎为100%第五十三张，PPT共一

40、百三十五页，创作于2022年6月1.带有互补的缺陷基因，诱导后不能裂解细胞（S基因缺陷），cI857。2.避免内源噬菌体被包装 采用删除原噬菌体b2区而使att位点缺损,这样原噬菌体不能从染色体上割离 内源噬菌体采用imm434 ，包装采用，感染imm434溶源菌，可阻止内源噬菌体形成噬菌斑，而带有外源片段的噬菌体可以成斑 重组缺陷以避免内源噬菌体与重组噬菌体之间发生重组对产生外壳蛋白大肠杆菌的要求：E-、S-D- ,S- gene对两种产生外壳蛋白内源噬菌体的要求：434 ： 噬菌体的近亲434第五十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2.3 单链噬菌体载体及噬菌粒载体M13，f

41、1,fd为大肠杆菌丝状噬菌体，基因组为单链环状DNA，长6.4Kb。M13噬菌体只感染带有F性须大肠杆菌，但其DNA可转染无性须的大肠杆菌2.3.1 M13噬菌体载体第五十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月(1) M13的生活周期噬菌体颗粒中的DNA为+链，通过性须进入细胞以+链为模板合成-链，形成RF DNA（复制形式DNA).RF DNA进行数轮复制， +链被切开，以-链为模板进行滚环复制新的+链，并在复制一圈后切割下来、成环。新的+链环继续变为RF DNA，其数目达到200个拷贝，基因V蛋白同+链结合，使-链无法合成，此时只能产生大量+链环状DNA单链链环状DNA被包装成新

42、噬菌体并挤压出细胞膜。宿主细胞不被裂解，只是生长速度变慢 Replication Form DNA第五十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月第五十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月(2) M13载体特点无包装限制制备及克隆操作方便可用于制备单链DNA 一般插入了MCS，及标记基因 虽然只有500bp非必需区段（基因II和IV之间），但包装限制方面优于噬菌体，包装长度可达基因组数倍。包装长度越长越不稳定，因此插入片段的长度有限，一般小于1.5Kb 细胞内有大量RF DNA, 可以用提取质粒的方法大量纯化，进行酶切、连接等操作。重组好的DNA又能高效转染宿主。 带有外源片

43、段的M13载体，在宿主中复制后形成的子代噬菌体包装单链DNA,因此可以制备大量单链DNA，用于Sanger测序或制备探针。（两条链都能方便的制备单链） 如lacZ的 Hind II片段（类似于 肽），宿主必须为lacZ M15突变株（缺第11-41个氨基酸残基，无法形成四聚体），便于筛选重组DNA。（外源片段插入Hind II片段中造成肽失活）.如果宿主为lacIq突变，则可表达超量阻遏蛋白，可以用IPTG进行诱导表达。（质粒表达载体一般携带lacI基因来解决该问题）第五十八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月lacZ Hind II 片段M13载体示例第五十九张，PPT共一百三十五

44、页，创作于2022年6月 为了克服M13噬菌体的缺点，开发了一类同时含有质粒复制子和丝状噬菌体复制起点的载体系列，称为噬菌粒（phagemid） 兼有丝状噬菌体和质粒的特点：存在辅助噬菌体时：滚环复制产生单链DNA、包装成噬菌体颗粒无辅助噬菌体时：质粒复制子控制复制，可制备大量双链DNA.分子量小，可稳定容纳长达10Kb外源片段，得到长的单链DNA,可省去外源片段从噬菌体载体转移到质粒上的亚克隆过程。克隆过程：载体、DNA片段的体外酶切、连接转化入宿主细胞（蓝白筛选）用辅助噬菌体感染含有重组噬菌粒的细胞收集噬菌体颗粒、制备单链DNA用于测序等后续研究2.3.2 噬菌粒载体第六十张，PPT共一百

45、三十五页，创作于2022年6月pBluescript噬菌粒载体蓝白筛选bla基因体外转录功能第六十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月第六十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2.3.3 M13 展示载体噬菌体表面展示技术：在噬菌体颗粒表面表达多肽或蛋白质技术。第六十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月主要内容1.细菌质粒载体 定义，分类，复制机理与方式，不稳定性与不相容性，可移动性 报告基因，质粒提取方法与原理2.噬菌体载体 噬菌体生活周期，主要调控蛋白的作用，载体特点及类型，克隆过程，体外包装过程及注意事项 M13生活周期，载体特点，噬菌粒 3.酵母细胞

46、载体及大容量载体4.动、植物载体第六十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月3. 酵母载体及大容量载体 3.1 酵母载体 3.2 柯斯质粒 3.3 人工染色体第六十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月3.1 常用酵母载体酵母是研究真核生物DNA复制、重组、基因表达和调控的理想受体细胞，也是一种重要的工业微生物，因此需要开发适用于酵母的载体。酵母载体主要是质粒载体： 整合型载体（yeast integerative plasmid, YIp) 复制性载体 （yeast replicating plasmid, YRp) 着丝粒载体（yeast centromere-cont

47、aining plasmid, YCp) 附加型载体（yeast episomal plasmid, YEp)特点：具有被E.coli识别的复制子和相应的标记基因，可在其中复制并大量制备。含有在酵母中使用的标记基因（与营养缺陷型宿主基因型互补）具有合适的限制性内切酶位点，方便外源基因的插入。第六十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（1）整合型质粒 YIp 该类质粒不能在酵母中自主复制，含有与酵母染色体同源的DNA区段，通过同源重组整合在酵母染色体上。转化效率低：约10个/gDNA，转化子非常稳定，常用于遗传分析。第六十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（2）复制性载

48、体 YRp与着丝粒质粒YCp酵母染色体总长为15,000 kb,根据电镜观察结果预计有400个自主复制序列（ARS, autonomously replicating sequence)，该序列可用于构建自主复制型质粒。 转化效率较高， 104个/gDNA 拷贝数高（120），不易分配给子代细胞，质粒分散不均匀 转化子不稳定，质粒容易丢失 可整合到染色体中，与YIp整合过程相同若在YRp质粒上加入酵母染色体的着丝粒序列（CEN)，则可增加质粒的稳定性（但拷贝数降低为1），这类质粒为YCp，其行为类似染色体，在有丝分裂与减数分裂中可稳定分配到子细胞。第六十八张，PPT共一百三十五页，创作于202

49、2年6月（3) 附加型载体 YEp多数酵母品系中含有一种隐蔽性质粒，称为2m质粒。该质粒的复制系统可以用于构建自主复制性的酵母质粒。 转化效率较高， 105个/gDNA 拷贝数高(25200)，转化子比较稳定 易于同内源性2m质粒重组第六十九张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月载体类型 存在方式 所需DNA序列 标记基因 转化频率 稳定性 （菌落/gDNA）无丝分裂 有丝分裂 整合型 整合 与染色体DNA Apr Tcr 10 +a +a (YIp5) 1-几个拷贝 同源 URA3 附加体型 自主复制 2质粒 Apr Tcr 103-105 -b - (YEp13) 多拷贝 LEU2

50、 复制型 自主复制 ARS Apr Tcr 103-104 -b - (YRp7) 多拷贝 TRP1 着丝粒型 染色体状 ARS,CEN Apr 103-104 +c +c (YCp19) 通常单拷贝 TRP1,URA3 线型 染色体状 ARS，CEN TRP1，HIS3 103-104 + + (YLp21) 通常单拷贝 TEL a. 每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来b. 在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNAc. 无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1% 酵母质粒的特征第七

51、十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月在染色体遗传作图、DNA文库制备、大片段基因克隆等方面需要应用比噬菌体容量更大的载体1978年由J.Collins和B.Bohn发展的柯斯质粒载体可满足上述需求噬菌体载体最大容量约23kb,实际一般15kb3.2. 柯斯质粒载体柯斯质粒，cosmid, cos site-carrying plasmid, 是一类人工构建的含有噬菌体cos位点和质粒复制子的特殊类型质粒。第七十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月柯斯质粒pHC79：由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成，全长4.3kb第七十二张，PPT共一百三十五页，创

52、作于2022年6月具有噬菌体的特性 可在体外包装成噬菌体颗粒，转导细胞后利用cos位点环化，采用质粒复制子复制，无法在胞内被包装。具有质粒载体的特性 质粒复制子和抗生素抗性基因高容量 对于5kb大的柯斯质粒，容量为3045kb,适合于克隆大片段DNA分子具有与同源序列质粒进行重组的能力 如果胞内还存在含有柯斯质粒同源片段的质粒，很容易形成两种质粒的共合体（1）柯斯质粒的特点第七十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（2）柯斯质粒克隆过程限制酶切割载体和外源片段两种片段混合连接体外包装感染宿主质粒环化、复制第七十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月大容量、低本底有效连接产

53、物所占比例较少，使克隆效率较低切割后的片段可能含有多个柯斯载体而造成不稳定可能在染色体作图中给出错误结果优缺点同噬菌体包装原理：含有多个cos位点的多连体被末端酶割，只在两个距离合适的cos位点处切割，相距过近（52kb)不切割。第七十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（3）改良的柯斯克隆过程Ish-Horowicz 和Burke方案H两份等量柯斯载体分别单酶切（H/S)后去磷酸化,再单酶切（B）切胶分离纯化左cos片段及右cos片段基因组DNA酶切处理、去磷酸化。左右cos片段和基因组片段混合连接体外包装感染宿主细胞由于大大提高了有效连接产物的比例，克隆效率较高（105/gDN

54、A)左右cos片段收率低，操作程序繁琐优缺点第七十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月Bates 和 Swift方案双cos位点的柯斯载体双酶切（B&S)基因组DNA酶切处理、去磷酸化。载体酶切产物与基因组片段混合连接体外包装感染宿主细胞第七十七张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月克隆位点两端相向插入不同启动子，可体外转录产生插入片段的两条链的转录本穿梭柯斯载体的构建插入片段易于从载体上切割分离（） 柯斯载体的其它改良第七十八张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月3.3 人工染色体载体根据染色体来源分为： 细菌人工染色体（BACs） P1派生人工染色体（PACs）

55、 酵母人工染色体（YACs） 哺乳动物人工染色体（MACs） 人类游离人工染色体（HAECs）人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具 人工染色体：artificial chromosome,指人工构建的含有天然染色体基本功能单位(包括复制起始点replication origin、着丝粒centromere和端粒telomere)的载体系统。第七十九张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月（1） 细菌人工染色体和P1派生人工染色体（ BACs and PACs)BAC和PAC是用于原核生物大肠杆菌内的人工染色体。BAC是以F因子为基础构建的环形质粒，容量为

56、300kbPAC则以P1噬菌体(P1 phage)为基础构建的环形质粒，容量为130-150kb。它们不是严格意义上的人工染色体，因为它们不含着丝粒和端粒。 第八十张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月一般结构：携带一个抗生素抗性基因、来源于 F 因子的严谨型控制复制子 oriS、 一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶repE基因 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因 （parA , parB , 和 parC） 拷贝数：BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。克隆能力：大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120

57、kb ，个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 可达 300kb BACs 第八十一张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月第八十二张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月1. 易于用电击法转化E.coli(转化效率比转化酵母高10-100倍)； 2. 超螺旋环状载体，易于操作；（YAC为线状） 3. F质粒的复制系统控制复制，复制稳定，12个拷贝，保证分配和结构稳定，很少发生体内重排。 4.宿主E.coli可以构建重组缺陷株，进一步提高BAC的稳定性（酵母细胞无法构建重组缺陷株） BAC的优点： 第八十三张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月基于 P1 噬菌体构建的

58、，与柯斯载体工作原理比较相似的一种高容量载体，含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70100kb 大小的基因组DNA片段。含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，包装容量可达 115kb。将重组 P1 噬菌体颗粒感染表达 Cre 重组酶的大肠杆菌，线状 DNA 分子进入宿主后通过载体上两个 loxP 位点之间的重组而发生环化。载体携带kan基因、克隆筛选系统（sacB系统）、以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DN

59、A 分离前质粒的扩增。P1 噬菌体载体（Bacteriophage P1 vectors）第八十四张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月P1 噬菌体载体克隆过程类似于cosmid：载体酶切、去磷酸化后产生长臂与短臂长、短臂同酶切去磷酸化的插入片段混合连接，形成多连体分子Pacase识别pac位点进行切割、体外包装感染cre+宿主,在胞内环化第八十五张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月2 loxP sequencespac sequence packaging P1 phage particleskanr: kanamycin resistence geneP1 plasmid

60、-replicon: circular DNA (1 copy/cell)P1 lytic replicon: controlled by lac promoter for plasmid amplification prior to DNA isolation(controlled high copy)sacB: positive selection for cloning foreign DNA (BamHI-site) between SP6 & T7 promoter第八十六张，PPT共一百三十五页，创作于2022年6月在连接过程中产生的环状重组 PAC 也可用电穿孔的方法导入大肠杆菌