科技攻关计划项目可行性研究报告

1、省科技攻关计划项目可行性研究报告省科技攻关计划项目可行性研究报告一、立项的背景和意义二十一世纪的生命科学将是基因科学，随着人类基因组图谱的全部破译，基因治疗肿瘤将使医学科学进入一个崭 新的时代。基因治疗技术研究的迅速发展，IL-24在肿瘤治疗方面将会 是一座新的里程碑。基因治疗恶性实体肿瘤是临床医生面临的挑战性 课题，由于肿瘤易转移的特性，使手术、化疗和放疗等传统治疗方法 对晚期肿瘤的治疗有限。研究表明，肿瘤生长的关键因素是血管形 成，实体瘤表达，如血管生长因子、碱性成纤细胞生长因子和血小板 源性生长因子等血管形成介导肿瘤产生新血管，利用原发肿瘤的血管 的形成而转移。因此，寻找抑制肿瘤生长和血

2、管形成进而阻止肿瘤转 移的方法尤为重要，基因疗法为恶性实体肿瘤的治疗提供了这种可能 性。理想的功能基因表达产物应能诱导肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤生长 和肿瘤血管形成，对正常组织细胞无明显毒副作用。白细胞介素 -24(IL-24 )具有上述功能。目前，利用白细胞介素-24 (IL-24 )对恶性 肿瘤的基因治疗，是发达国家的研究热点之一。白细胞介素-24 (IL- 24) 是1995年Jiang H等人首先克隆并分离出该细胞因子，原名称黑 色瘤分化相关抗原(mda- 7) , 201X年，mda- 7因其分子结构、基因 定位和细胞因子样特性而被正式命名为白细胞介素24 (IL-24 )。研究表明，借

3、助腺病毒表达载体，将人白细胞介素- 24基因转染肿瘤细 胞，可特异性抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡，但不会影响正常细 胞。IL-24的这种作用在至少50余种人类恶性肿瘤细胞实验中得到证 实，包括黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、第1页共17页 肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。可以认为 IL-24是目 前发现的唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表达刺激免疫系统的蛋白基因。目前，P53、P10、Rb等抑癌基因正在用于基因治疗的临床试验（其中重组人P53腺病毒注射液已在我国生产上市，也是世界上第一个上市的基因治 疗药物），但均不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性。所 以，通过

4、比较可以证明IL-24的研究有着重要的临床意义。通过腺病 毒介导人IL-24基因进行治疗肿瘤的基因治疗的技术，具有非常重要 的社会、理论和临床意义。基因治疗产品使细胞产生内源性的目的蛋 白质或多肽，产生特异的生物治疗。基因治疗使给药更加特异、高效 和安全，达到医学科学所期望达到的最高目标。基因治疗药物将对基 因工程蛋白质或者肽类药物也形成严重的挑战，用基因治疗方法可代 替反复使用、费用极高的蛋白质药物，一次注射，可带来长久的疗效 或根治。据世界卫生组织（WH。统计，全世界每年有500多万人死于 各种癌症，每年各种癌症患者多达 2200万人。我国每年约有600万肿 瘤患者，假如有百分之一的患者使

5、用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”，治疗一个疗程，用药 20支，其用量为120万支，按每支201X 元人民币计算，国内市场为24亿元人民币，国内外市场的百分之一为 44亿元人民币。所以，基因治疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生 活质量的高科技项目。该项目是我单位独立研究的基因治疗项目，现 已独立完成了人白细胞介素一24基因的克隆。从中国人外周血中分离 的单核细胞中克隆出人白细胞介素一24的基因，经测序与国外公布的 人IL-24的基因序列一致，说明我们已得到人IL-24的基因。正进行第2页共17页 重组腺病毒载体的构建。本单位是生物医药研究、开发、生产、经营 的专业化企业，是山东省高新技术

6、企业，十余年来承担了多个项目的 研究。独立研究的IL-2 (125ser)是山东省火炬计划项目、IL-18是 201X年山东省重大科技攻关项目、G-CSF是济南市星火计划项目、 - 2b干扰素抗病毒口含片是201X年山东省SAR躲合防治技术研究药物 开发中标项目、重组人新型溶栓酶是 201X年济南市科技发展计划项 目，其中IL-2 (125ser)获省、市、区科技进步奖，并获国家科技部 等五部委联合颁发的国家重点新产品证书。有较强的生物技术药 物研究开发能力。该项目的成功开发及产业化，势必将带动我国整个 生物高新技术的发展，并构成一个生物高技术平台，一个巨大的产 业，一个新的经济增长点。同时，

7、不仅能够在临床上有着重要的治疗意 义，而且能够对广大肿瘤患者提供一条崭新的治疗途径，也将会对生 命科学的发展和山东省经济的发展起到一定的作用。二、国内外现状和发展趋势：经检索，在国内，只检索到军事医学科学院和苏州大学细胞和分 子生物学教研室对IL-24基因的克隆及在大肠杆菌中的表达文献，未 发现利用腺病毒介导人IL-24基因来治疗肿瘤的报道。也未发现利用 AdmaX泉病毒表达系统来介导人白细胞介素- 24基因治疗肿瘤的专 利。所以，我单位研制的重组人白细胞介素-24腺病毒注射液可形成自 己的知识产权。在国外，只有美国等少数发达国家对携带IL-24基因的重组腺病毒进行研究，尚未有对其开发成药物的

8、报道。目前国内未 发现有对IL-24进行药物研究的单位和个人。我单位从上世纪八十年 代中期开始对生物技术进行研究，基本与国外同行业同步。已独立研 制成功了 IL-2 (125ser)、IL-第3页共17页18、G-CSF % -2b干扰素抗病毒口含片、重组人新型溶栓酶等生 物技术高科技成果产品。拥有一支素质较高、经验丰富的科研队伍。 已对该项目进行了一年多的研究，已完成人白细胞介素一24基因的克隆。从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素一24的基因，经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致，证明我们已得 到人IL-24的基因。正进行重组腺病毒载体的构建。基因治疗的关键 技术是表

9、达系统，腺病毒表达系统被广泛用于基因治疗、基因功能性 研究、反义治疗、疫苗开发等领域。我单位利用AdmaX泉病毒表达系统来介导人白细胞介素24基因治疗肿瘤，AdmaX泉病毒载体系统比 现有的其它腺病毒载体系统更有优势，具有构建简单、出毒快、单细 胞病毒产量高等优点。三、现有研究基础、特色和优势1、现阶段已达到的主要技术指标和经济指标(1)现阶段已完成人白细胞介素一24基因的克隆。(2)从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素一 24的基因，经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致，说明我们 已得到人IL-24的基因。(3)正进行重组腺病毒载体的构建。2、项目的创新点及在人才、资源

10、和产业方面的特色优势重组人白 细胞介素-24腺病毒主要创新点：(1)、白细胞介素一24是新发现的抗肿瘤细胞因子，国内外均 未上市。第4页共17页、利用AdmaX泉病毒作载体将IL-24基因介导到人体，对肿 瘤细胞进行基因治疗的方法。腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为 载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工 和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水 平表达并且具有完全的功能。腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人 类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳 动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人

11、类的大多数的肿瘤就是上皮细胞 来源的。因此，腺病毒载体系统具有靶向性，使其可以靶向特定的组 织或细胞内复制增殖，表达目的基因，直接作用于病灶，抑制肿瘤细 胞生长，诱导其调亡。（3）、AdmaX泉病毒表达载体具有构建简单，出毒快，单细胞病 毒产量高等特点。AdmaX泉病毒系统是由腺病毒载体鼻祖 Dr.Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是 通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载 体穿梭质粒和辅助质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生 重组腺病毒。得到的重组病毒是 E1/E3缺失的复制缺型腺病毒。与目 前使用最

12、普及的AdEasy系统相比，有一定的优势：AdMa媒统只需要24周就能完成从质粒构建到重组出毒，成功 率大于98% （其中95%勺克隆含有目的基因），因在真核细胞内重组出 毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整 性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34% （Stratagene公司新版 的AdEasy XL系统成功率在94施右），且在原核细胞（BJ5183）中完 成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易第5页共17页 发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。人才、资源和产业 方面的特色优势：本单位是山东省科技厅认定的高新技术企业及重点联系单

13、位。在 人才、资源和产业化方面具备如下优势：1、有研究开发基因药物的专业机构-生物技术研究所。配备有较 完善的科研生产检测仪器和设备(DN始成仪、PCFT增仪、70L贝克 曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白层析系统、 Waters的高效液相、万级净 化级别的实验室等)。2、拥有一支经验丰富、老中青相结合的科研队伍。已开发出的国 家级新药“重组人白细胞介素-2 (125ser) ”和“重组人粒细胞集落 刺激因子”，并已获得国家药品监督管理局颁发的新药证书和批准文 号，现已投放市场。3、有一座4000m2的GM酢准的生物药品生产车间(GMPE书编 号：C1064 ,年生产药品能力可达千万支。4、有完善的科

14、研协作网络。我单位与“美国俄亥俄州立大学分子 生物学中心”、“中国协和医科大学”、“山东大学药学院”等国内 外大专院校和科研院所有紧密合作关系。本项目是与中国协和医科大 学共同合作研究的科研项目。5、我单位科研工作经验丰富，承担过省、市、区级科研项目多 项。上述条件，为“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”的研制奠定 了基础。四、应用或产业化前景、市场需求人白细胞介素-24 (IL-24) 是目前发现的唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表达刺激免疫系统的 具有双重功效的蛋白基因。研究表明，借助腺病毒表达载体，将人白第6页共17页 细胞介素-24基因转染肿瘤细胞，工业滤布可特异性抑制肿瘤细胞生 长，诱导

15、其调亡，但不会影响正常细胞。IL-24的这种作用在至少50 余种人类恶性肿瘤细胞实验中得到证实，包括黑色素瘤、神经胶质细 胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺 癌、胰腺癌等。全世界每年有 500多万人死于各种癌症，每年各种癌 症患者多达2200万人。我国每年约有600万肿瘤患者，假如有百分之 一的患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”，治疗一个疗 程，用药20支，其用量为120万支，按每支201X元人民币计算，国 内市场为24亿元人民币，国内外市场的百分之一为 44亿元人民币。 该项目产业化后，可年产100万支，实现产值20亿元人民币，年销售 收入可达12亿元人

16、民币，年利税6亿元人民币，年创汇201X万美 元。所以，基因治疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量的高 科技项目。同时，对包装、印刷、玻璃制品等行业起到带动作用。五、研究内容与预期目标研究内容：1、人白细胞介素-24基因的克隆2、重组人白细胞介素-24腺病毒的建立3、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法的 建立4、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的抗肿瘤实验总体目标本 项目预计投入800万元人民币。可完成基础性研究，获得重组人白细 胞介素-24腺病毒注射液样品，整理出科研文献。本单位现有资产1.6亿元人民币，员工116人。经济目标项目完成时，预计年新增产品销 售额300

17、0万元、年新增交税总额200万元、年新增净利润1000万第7页共17页 元、年新增创（节）汇200万美元、年新增产值4000万元。技术、 质量指标：参照国家 人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则、中国生物制品规程、中国药典（201X年版）等要求建立重组人白细胞介 素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素 -24腺病毒制品的病毒纯度、病毒7前度的测定和复制型病毒（ RCA、 腺相关病毒检测的方法学进行研究。1、比活性：病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定，3.3%。2、复制型病毒（RCA的检测：A549细胞检测法，每3.0X1010VP中应不高于1RCA（即 W1

18、RCA/3.0X1010VP 。3、腺相关病毒的检测：采用PCR&,应无腺相关病毒（AAV的污染。4、病毒纯度检测：采用高效液相色谱法或A260/A280法纯度大于95%本项目属科 技攻关项目，主要是完成技术性研究，取得该技术领域的科研成果。产业化达产后，预计可实现产值 10亿元人民币，年销售收入6亿元人 民币，年利税3亿元人民币，年创汇1000万美元。用腺病毒携带IL- 24 基因治疗肿瘤的方法可形成专利。六、研究方案、技术路线、组织方式与课题分解1、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的技术方案1.1重组人白 细胞介素-24腺病毒的建立第8页共17页(1)人白介素-24基因的克隆从人外周血单

19、个核细胞中提取 mRNA设计并合成特异引物，应用 PCR勺方法扩增得到人白细胞介素- 24的基因片段。 人白介素一24基因序列的确证将用PCFT增出的人白介素 -24基因，进行测序，并与 GeneBank艮道的结果比较，以确定扩增的 白介素一24基因序列的正确性。(3 )携带人白细胞介素一24基因腺 病毒穿梭质粒载体的构建与鉴定采用基因工程的方法，将人白细胞介 素-24基因克隆至腺病毒穿梭质粒载体中，通过限制性内切酶图谱法 鉴定人白细胞介素-24基因是否重组到腺病毒穿梭质粒载体中。(4)重组人白细胞介素-24腺病毒的构建通过脂质体转染技 术，将携带人白细胞介素-24基因腺病毒穿梭质粒载体转染2

20、93细胞 (人胚肾细胞)，提取重组腺病毒 DN破彳f PCRg定。(5)扩增前重组人白细胞介素-24腺病毒的空斑筛选利用噬斑 纯化方法，将感染重组腺病毒的293细胞进行培养，挑选出单个重组 腺病毒，以保证扩增的纯度和稳定性。(6)重组人白细胞介素-24腺病毒的扩增、纯化将经噬斑纯化 获得重组腺病毒大量感染293细胞，以大量生产重组腺病毒。待感染 病毒的293细胞成熟后收获细胞，经反复冻融及离心等方法，除去细 胞碎片，收集上清，获得重组腺病毒。并通过超滤和离子交换的方法 来纯化和浓缩重组腺病毒，从而获得大量、高滴度、高纯度的重组人 白细胞介素-24腺病毒样品。1.2、重组人白细胞介素-24腺病毒

21、注射液的质量控制和检测方法的 建立参照国家 人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则、中国生物制品规程、中国药典(201X年版)等要求建立重组人白细胞介第9页共17页 素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素 -24腺病毒制品的病毒的纯度、病毒滴度的测定和复制型病毒(RCA、腺相关病毒检测的方法学研究。(1)比活性：病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定(2)复制型病毒(RCA的检测：A549细胞检测法，每3.0X1010VP中应不高于1RCA(即 W1RCA/3.0X1010VP腺相关病毒的检测采用 PCFfc,应无腺相关病毒(AAV的 污染。(4)病毒纯度检测采用

22、高效液相色谱法或 A260/A280法纯度大 于95% 1.3重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的抗肿瘤实验将重组 人白细胞介素-24腺病毒注射到肿瘤细胞，观察重组人白细胞介素 -24 腺病毒抗肿瘤效果。2、本企业在生产场地、公用工程、辅助设施等方面已具备的条件 和需新增加的基本建设内容。我单位有研究开发基因药物的专业性生 物技术研究所，有着从事多年生物技术药物研究和开发经验，曾研制 出“注射用重组人白介素-2 (125Ser)、滤布注射用重组人白介素- 18、-2b干扰素口含片、新型溶栓酶”等高科技生物药品，具有 良好的科研基础。配备有较完善的科研生产检测仪器和设备：DN给成仪、PCRT增仪

23、、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白 层析系统、Waters的高效液相、万级净化级别的实验室等。现有生物 药品GM性产车间和两条生物药品生产线，具备良好的生产条件。第10页共17页3、述生产过程中“三废”排放、“三废”处理的措施和生产过程 中职业危害因素分析及采取的保护措施方案。重组人白细胞介素-24腺病毒注射液研制和生产过程，无三废排放。4、特殊行业许可证报批情况我单位企业法人营业执照(执照号：3700001806766、药品生产企业许可证(证号：鲁01Sz201X002O和药品GMPE书(证书编号：C1064等证照齐全。5、说明本项目推广应用计划和保障措施(1)本项目研制成功后，我单位自

24、行生产。(2)本单位有一座4000m2 GM标准的生物药品生产车间，具有 完备的生产仪器、设备，年生产能力可达上千万支生物制剂。(3)本单位有专业销售公司，销售网络遍布全国30多个省市自治区，本项目产业化后即可上市推广。(4)该项目有着巨大的社会意义和经济效益，公司对该项目极为 重视，不但组织了科研能力较强的专职研究队伍，加大资金的投入， 而且组织了由5位国内著名院士、6名知名专家组成的专家组，对“重 组人白细胞介素-24注射液”基因治疗项目进行了论证指导，保证了 本项目的可行性。七、年度计划内容：本项目计划为三年201X年1月-201X年6月载体的构建经费投入 预计300万元201X年7月-

25、201X年12月 载体的鉴定经费投入预计 100万元201X年1月-201X年6月重组腺病毒的扩增纯化经费投入预 计100万元201X年7月-201X年12月 重组腺病毒的质量研究经费投 入预计100万元201X年1月-201X年12月 重组腺病毒的抗肿瘤细胞 实验经费投入预计200万元第11页共17页八、主要研究人员和单位简况及具备的条件1、主要参加人员情况邹立家，研究生导师，药理、药学专业教 授，在药理、药学学科方面有着很深的造诣和贡献，有著作 5部，科 研成果8项。曾参加研制开发IL-2 (125Ser)、IL-18的工作；现参 加白介素-24 (IL-24 )的研制开发工作，并任课题组

26、负责人。韩代 书，博士、教授，中国协和医科大学博士生导师，细胞生物学专业教 授，在细胞生物学学科方面有着很深的造诣和贡献，有数十篇论在国 际刊物上发表。是本单位科研课题组主要成员。王加旺，博士，微生 物专业，有6篇论文在国家级刊物上发表，曾参加IL-2 (125Ser)、 IL-18的工作、0c -2b干扰素抗病毒口含片、新型溶栓酶等项目的研究 开发，是本单位研究所课体组主要成员。苑波，博士后、教授，长期 在美国从事基因组学科技研究，是美国著名的基因组学科学家，201X年被美国政府评为“十大科技青年”，近年来一直与我单位合作。课 题组其他成员均在生物技术研究所长期工作，是“注射用重组人白介 素

27、-2 (125Ser) ”课题组原班人马，他们在“白介素-2(125Ser) ”、“rhG-CSF和“IL-18”等高科技产品的研制开发过 程中做了大量的工作，取得了优异的成绩，被济南市科技局评为“科 技先进集体”、被济南市药监局评为“科技进步先进集体”。2、单位法人近几年来研究开发业绩我单位法人长期从事科研工 作，带领企业承担了国家级、省级、市级星火计划、火炬计划、科技 攻关、技术改造、重点工业项目等十几项科研开发及产业化项目，被 广泛应用于社会各重要领域，多项成果填补了国家空白，取得了令人 瞩目的成绩，受到各级政府和社会各界的充分肯定和高度评价。主要 科技成果3项，科技著作2部。并领导本单

28、位全体科研人员研制出了第12页共17页“注射用重组人白介素-2 (125Ser) ”、“重组人粒细胞集落刺激因 子注射液(rhG-CSF) ”、“注射用重组人白细胞介素-18 (IL- 18) ”、“新型重组溶栓酶”、“ -2b干扰素口含片”等多项生物技 术药物。“注射用重组人白介素-2 (125Ser) ”和“重组人粒细胞集 落刺激因子注射液(rhG-CSF) ”两项新药分别被列为国家星火计划 项目和山东省火炬计划，山东省技术改造导向计划，济 南市三十项重点技术改造项目。其中“注射用重组人白介素-2(125Ser) ”的各项主要技术指标，均达到国际领先水平，填补了国 内空白。被国家五部委(中

29、华人民共和国科学技术部、国家税务总 局、中华人民共和国商务部、中华人民共和国国家质量监督检验检疫 总局、国家环境保护总局)认定为“国家重点新产品”，获山东省科 技进步一等奖。在抗癌科研方面也做了长期大量的工作，正式发表的 文章已被国外学术杂志引用，被聘为“山东省抗癌协会”常务理事， 201X年被“国际儿童癌症治疗联合会”聘为高级顾问。企业投资上亿 元建起了生物工程药品生产基地。建有 GM注物制药生产车间、科研 综合楼、办公楼等16000多平方米的基础设施，并从发达国家引进了 先进的科研、生产设备仪器，建立了产学研一体化的产业基础。3、单位技术装备水平、实验仪器状况。(1)我单位现已具备4000

30、m2的GM吐产车间(GMPE书编号： C1064(2)研究开发基因药物的生物技术研究所，多年从事生物技术药 物的研究和开发，具有良好的科研基础。(3)研究所配备有较完善的科研生产检测仪器和设备：第13页共17页DN给成仪、PCFT增仪、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白 层析系统、Waters的高效液相和万级净化级别的实验室等。九、经费 预算项目总投资800万元，申请科技三项经费100万元，自筹440万 元，银行贷款250万元，省科技经费拨款10万元。其中已完成投资 100万元。划项目可行性研究报告编制提纲一、立项的背景和意义主要说明：1、技术来源，包括国外技术、国内技术、自有技术及合作开发

31、、 引进消化吸收。2、研发形式，包括与本市、本省、国内外院校及研发机构合作。3、曾列入国家哪类科技计划项目、获奖及专利情况。4、对国家或我市经济和社会发展的意义作用。二、国内外现状和发展趋势包括知识产权现状主要说明：1、国内外基本情况及发展趋势。2、申请承担单位目前研发应用情况。三、现有研究基础、特色和优势主要说明：1、现阶段已达到的主要技术指标和经济指标。2、项目创新点及在人才、资源和产业方面的特色优势。四、应用 或产业化前景、市场需求。主要说明：1、结合发展趋势和基础优势说明，主要应用领域及对相关产业的 带动作用及国内外市场需求。2、具体说明已有和有待开发的市场情况。五、研究内容与预期目 标（此栏目各项指标是项目立项后，签定合同的主要内容，也是项目验 收的主要依据）第14页共17页1、总体目标，包括项目执行期间预计投资总额、项目完成时实现 年生产能力、单位资产规模和单位人员规模等。2、经济目标，包括项目实施期间实际达到的年度指标、完成时预 计可实现的年销售收入、年交税总额、年净利润、年创汇额等。3、技术、质量指标，包括项目完成时，项目达到的主要技术性能 指标、单位通过的质量认证体系、产品执行的质量标准、产品通过的 国家相关行业许可认证以及获得专利等知识产权情况。六、研究方案、技术路线、组织方式与课题分解主要说明