医学专题一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011

1、1第一章、植物病原真菌的分离、 培养及纯化技术2021/7/20 星期二21）材料：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml1、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基马铃薯葡萄糖琼脂：potato dextrose agar, 简称PDA；马铃薯蔗糖琼脂： potato sucrose agar, 简称PSA。一、真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌2021/7/20 星期二32021/7/20 星期二42）制作步骤马铃薯洗净，去皮称200g切块/条，1000ml水煮沸30min，用双层纱布滤去薯块，加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤

2、，补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中，塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。 2021/7/20 星期二5自然pH；调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.56.5之间，最后加水补足至1000mL。Tips: 实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。2021/7/20 星期二62、植物组织和煎汁 许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。 植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植

3、物的煎汁都可用作培养液，如加琼脂即能制成固体培养基。 当然，必须灭菌后才能使用。2021/7/20 星期二73、培养基的分装根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中。试管分装时，使用玻璃漏斗。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的1/3-1/2。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。2021/7/20 星期二8制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。4、灭菌高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。分离培养时需要的培养皿等

4、，要事先洗净、晾干/烘干、包装好，进行干热灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。2021/7/20 星期二9 滤膜孔径主要有0.22 m和0.45m两种。过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。2021/7/20 星期二102021/7/20 星期二115、斜面、平板培养基的制作试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培养基。三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。方法是：将培养基冷却至4550（低于45易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右

5、手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。2021/7/20 星期二12二、真菌分离 植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。2021/7/20 星期二13真菌的分离-就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。 一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环

6、境，从而得到纯菌株。 2021/7/20 星期二14 观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出诊断。 同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生长的腐生性真菌。 因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。 此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培养物是必要的。（一）目的意义2021/7/20 星期二15分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下进行。（二）、真菌分离的程序1分离前的准备工作2021/7/20

7、星期二161.1 清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。 为了保证无菌操作，应注意下面几点：1.2 若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。2021/7/20 星期二171.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；1.5 无菌操作前还要用70酒精擦手；1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。2021

8、/7/20 星期二18分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。 病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。 最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。2分离材料的选择2021/7/20 星期二19 例如：果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的部分分离。值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到病菌的。当然，这类病害是比较少的。从受害的边缘部分分离这一原则

9、，对于绝大部分病害都是适用的。2021/7/20 星期二20 采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得较多的是植物病原细菌的分离。 引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平

10、板上，病菌即生长而得到纯培养。2021/7/20 星期二21 （1）酒精 用酒精（70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟到1分钟），然后用灭菌水冲洗；较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧去。 3组织的表面消毒剂2021/7/20 星期二22配方为：升汞 1g，浓盐酸2.5mL，加水 至1000mL。 将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。 升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。 消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般35分钟。消毒后用无菌水冲洗34次。（2）升汞溶液（0.1%）2021/7/20 星期二23（3）

11、次氯酸钠NaClO3 由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效果，目前多改用次氯酸钠. 消毒所用的浓度一般是3%-5%的水溶液，消毒时间5-15分钟。 幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。 比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗8、9次。 2021/7/20 星期二244常规分离方法植物病原真菌的分离方法主要有两种： 组织分离法和稀释分离法。组织分离法是最常用的方法.稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。2021/7/20 星期二25植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水洗过以后，移殖在琼脂

12、培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭菌水洗过以后培养。 4.1 组织分离法2021/7/20 星期二261）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成5mm5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。注: 选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。 植物病原真菌的组织分离的技术与步骤：2021/7/20 星期二272）向装有病组织的小碟中加入70%酒精（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉酒精。 注:先用70的酒精浸2、3s是为了消除

13、寄主表面的气泡，减少表面张力，70的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。2021/7/20 星期二283）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些一般情况下，需时间3、5min。 2021/7/20 星期二294）向小碟中加灭菌水，冲洗3-4次（除去残留的消毒剂），将病组织转移到灭菌滤纸上吸去多余的水（以大大减少病组织附近出现细菌污染）。2021/7/20 星期二305）将吸干水分的病组织移

14、到预先倒好的PDA平板上，注意要用镊子轻压组织使其着靠在培养基上。 2021/7/20 星期二316）每皿5块，均匀摆放，倒置于25培养箱中培养。4-5天后检查结果。写明日期、姓名等。2021/7/20 星期二32各种真菌病害发生的部位和症状不同，其分离要根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典型材料的分离法。 4.1.1 斑点病病原真菌的分离4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离4.1.3 根腐病菌的分离4.1.4 肉质组织中病菌的分离4.1.5 种子内病菌的分离法2021/7/20 星期二334.1.1 斑点病病原真菌的分离 从病斑切取每边约3-5mm的小块病组织，用70%的酒精浸几秒

15、钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液中浸3-5分钟；而后用灭菌水换洗3次，将其移置在琼脂培养基平板上培养。2021/7/20 星期二344.1.2 维管束组织内病原真菌的分离2021/7/20 星期二35 从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。2021/7/20 星期二364.1.3 根腐病菌的分离 根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。材料小的可以仿照斑点病的分离法。材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。 2021/7/20 星期二374.

16、1.4 肉质组织中病菌的分离 多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。2021/7/20 星期二382021/7/20 星期二39种子如在未破裂的果荚内，可以不经过表面消毒，在无菌的条件下取出移在培养基平板上培养。4.1.5 种子内病菌的分离法 将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒（升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在琼脂培养基平板上培养。2021/7/20 星期二40 稀释法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离细菌和酵母菌等。4.2 稀释分离法植物病原真菌的分离一般很少

17、用稀释法分离，但有些产生大量孢子的病原真菌和霉菌，可以配成孢子悬浮液稀释分离。2021/7/20 星期二41方法：用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至45的培养基，轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。2021/7/20 星期二424.2.1 孢子分离法 产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属(Phoma)等，则可配制成

18、孢子悬浮液,以稀释法或划线法分离。2021/7/20 星期二43 许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面或者悬挂在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。 2021/7/20 星期二44典型的是担子菌亚门大型真菌担孢子的分离和获得： 担孢子无色或有色，浅色的担孢子需要成团堆积时方能辨识，一般是依靠“孢子印”。2021/7/20 星期二45 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。 分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。4.2.2 土壤带菌分离法2021/7/20 星期二46稀释倒平板

19、法示意图2021/7/20 星期二47稀释涂布法示意图2021/7/20 星期二481.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 1072. plate out 0.1 ml 平板稀释法2021/7/20 星期二49图 平板划线分离法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法2021/7/20 星期二50平板划线方法示意图2021/7/20 星期二51 分离真菌时经常有细菌污染。将培养基调节至酸性反应，如在10ml培养基中加1-2滴25%的乳酸，可使大部分细菌受到抑制，而并不影响真菌的生长。4.3 细菌污染的排除2021/7/20

20、 星期二52培养基中加适当的抗菌素是抑制细菌生长很有效的方法。 加金霉素(30ug/ml)可抑制多数细菌的生长， 加青霉素(20ug/ml)可抑制革兰氏阳性细菌的生长， 加多粘霉素B(5.0ug/ml)可抑制G阴性细菌的生长， 加链霉素(40ug/ml)或氯霉素(50ug/ml)可以抑制大部分细菌的生长。除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后并冷却到45左右时加入(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)。 2021/7/20 星期二535、内生真菌的分离 先将健康组织，如：叶片和茎，用自来水冲洗干净、晾干水分后, 剪成约1.5cm1.5cm的小片(叶)或1.5cm长的小段(

21、茎)。按下列程序进行表面消毒: 70%酒精漂洗30s0.1%升汞漂洗1min 70%酒精漂洗30s无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分。将上述处理过的材料在无菌状态下剪切成0.5cm0.5cm 小片（剪去0.5cm的边缘），或0.30.5cm长段移植于含链霉素的供试培养基上（PDA、Czapek、煎汁培养基）, 于261黑暗条件下培养，待组织块边缘有菌丝长出后，及时挑取菌丝尖端转入PDA平板上培养。2021/7/20 星期二54 用丝瓜诱发瓜果腐霉：Pythium aphanidennatum6、土壤真菌的诱发技术与步骤： E、进一步纯化，保存备用。D、在25下放置4-5天后，瓜上长出大量白色

22、棉絮状的菌丝体，即为所需真菌。C、将丝瓜切段，切口端插入土中。B、加入少量自来水，将菜园土混合成糊状。A、将菜园土装于玻璃杯中（约半杯）2021/7/20 星期二551）先用剪刀将每粒大麻籽一分为二，然后在水中煮沸，进行简单灭菌。7、水生真菌的诱发技术与步骤：4）进一步纯化，保存备用。3）2天后开始换水，即将培养皿中的混合水全部倒掉，再加入约15ml灭菌水，以后每天换灭菌水一次，一般4-5天后即可从大麻籽上长出菌落，通常为Saprolegnia spp. 或Achlya spp.。2）每人取3个灭菌培养皿，在每一培养皿中加入3-4瓣经简单灭菌的大麻籽，然后分别加入14、12、10ml灭菌水，再

23、分别加入1、3、5ml池塘水，置25培养。2021/7/20 星期二56分离工作有时不很顺利，失败的原因很多，以下几点值得首先加以考虑：（1）材料是否新鲜，标本中的病菌是否存活，其中杂菌滋生的情况；（2）表面消毒所用的药剂和处理方法是否适宜；（3）培养基是否适当，包括它的化学性状和物理性状；（4）培养的条件是否适宜，受低温、高温和其他因子的影响；（5）病原生物的生物学特点，它对于腐生条件的适应能力 （三）分离结果与分析：2021/7/20 星期二57三、培养culture病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。2021/7/20 星期二58每皿组织块均匀摆放，干水，轻压；培养皿倒置或正放；于25-27 培养箱中培养；黑暗或光照，或光暗交替；日光灯，紫色光，黑光灯等；2-3天后检查结果；写明日期、姓名等。2021/7/20 星期二591菌落的质地；2菌落是