研究共振光散射技术在药物分析中的应用

1、研究共振光散射技术在药物分析中的应用摘要：对共振光散射技术在药物与生物大分子分析测定中的应用状况及其进展进行了综述。重点介绍了该方法在生物体液中药物的分析和中药成分的分 析应用前景。为体内大分子药物及其他药物成分的检测方法研究提供了新途径。 关键词：共振光散射技术；药物分析共振光散射(resonance light scattering , RLS)!利用普通荧光分光光度 法对散射光进行测量的一种散射光分析技术。该技术由于其简单、快速、灵敏的分析特点，吸引了生命科学、分析化学、环境科学、材料科学等领域的分析工作 者对其理论和应用进行了深入的研究， 促进了分析学科内部各个分支之间的，尤其是在生化

2、领域已经取得一定的研究成果。光散射现象广泛存在于光与粒子相互作用的过程中，当介质中粒子的直径 (d)与入射光波长(入0)存在d0入0时，产生的是以瑞利(Rayleigh)散射为主的 分子散射光。根据RLS理论可以得到散射光强度与散射粒子的浓度 c成正比的关 系，即IRLS=Kcb据此可以用于大分子物质溶液的分析测定。RLS分析法灵敏度高，操作简单方便，可通过普通荧光分光光度计同步扫 描得到完整的RLS特征光谱和相应RLS峰。由于RLS法源于Rayleigh散射光吸 收光谱，它对分子结构大小和形状(如球形、链形、无规则线团等)、电荷分布、 键合性质等研究还能提供新的、更丰富的信息。近年来的研究证

3、明，RLS法还可用于痕量金属、表面活性剂以及纳米材料4,5等方面的研究测定。该方法一般 不需要对样品进行复杂的化学预处理， 避免了一系列烦琐的操作程序，而直接将 处理好的样品溶液置于普通的荧光分光光度计中进行测定即可。1体液中生物大分子的测定 蛋白质蛋白质的功能很多，与生命的起源和生物的进化、细胞结构、病毒、免疫、 酶、激素、物质的遗传等有密切的，它是生命现象的物质基础。蛋白质定量测定 是生物化学和生命学科中经常涉及的分析内容，在临床医学中也有重要应用。目 前，蛋白质测定方法主要有 Lowry法，Bradford法，Biuret法，Bromoeersol Green 法与Bormophenol

4、 blue法等。Pasetmack将RLS技术用于测定微量蛋白质以来， RLS法分析技术以其方法简单、快速、灵敏度高，在生物大分子分析测定研究中 的报道日益增多，灵敏度可达纳克级11。黄承志等研究了阴离子表面活性剂罗丹明 B(Rhodamine B, RhB)十二烷基硫酸钠灼 蛋白质体系的RLS光谱特征。实验发现，SDSt HSA（humarserum albumin , HSA结合后再与RhB作用，具散射光强度增强。且 RLS增强的程度与 蛋白的浓度在一定范围内呈线性关系。据此，建立了一种测定人血清中总蛋白质的新方法12 0胡之德等基于在的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醴（OP）对亮丽春红5R

5、蛋白质体系的RLS信号有强烈的增敏现象，建立了 0P蛋白质 亮 丽春红5R三元体系测定人血清中蛋白质浓度的新方法。该体系对人血清白蛋白 检测的线性范围在pg - ml-1之间，检测限为ng - ml-1 ,检测实际样品的回 收率在7%之间，方法令人满意13。王锡宁等利用RLS技术测定白蛋白、红蛋 白。研究了间苯二酚黄QP蛋白质体系RLS光谱特性，确定了在nm处，问苯二酚黄浓度为X 10-5 mol - L-1 , OP的浓度为X 10-5 mol - L-1时为最佳反应 条件，据此建立了一种灵敏度高的测定蛋白质的新方法14。薛蓿等研究了流动注射介1DHLS技术联用在线测定人血清中蛋白质含量。以

6、SDS为荧光探针，利用未曾报道过的RLS与FIA联用检测人血清样品中蛋白质含量。与单纯用RLS法测定比较，分析时间由40 min缩短至1 min, RLS信号的重现性得到了显著改 善，提高了实验的灵敏度和重现性15 o梁宏等在普通荧光分光光度计上选择合 适的激发光和发射光通带宽度，利用RLS技术，研究了生理pH值（土）, 25 C下， 金（田）与血清白蛋白的相互作用。首次观测到金（田）对血清白蛋白的RLS强度随 着金（田）浓度增加而降低。结果表明，金（田）与血清白蛋白的结合会破坏血清白 蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫桥键断裂， 导致白蛋白分子趋于松散，散 射截面积减小，表现为RLS强度降低

7、16。核酸核酸是遗传信息的载体和基因表达的物质基础，在生物的生长、发育等活 动中具有十分重要的作用。目前核酸分析测定的方法主要有分光光度法、荧光光度法、化学发光法、探针技术法、免疫分析法等，其中分光光度法17和荧光光度法18使用较多。紫外分光光度法操作简单，但由于灵敏度低，测定的干扰因 素多，使其在应用上受到了限制；荧光分析法具有选择性好和灵敏度高，但荧光 试剂价格昂贵，而且部分荧光试剂有致癌活性。针对上述情况，RLS法因操作简便快速，灵敏度高，试剂无毒性等优势，在核酸分析中也得到了广泛的应用。黄承志等利用澳化十六烷基三甲俊i y I t-,ir-：； i.liy lu.rirons i J

8、iibromide,CTMAB）阳离子表面活性剂，核酸因带有大量的磷酸根而带负电荷的特 性，证明了 CTMA则核酸通过静电引力共吸附到液/液界面上形成两性复合物， 导致强烈增加的全内反射共振光散射 （total internal reflected resonance light scattering 虚吸5信号，TTR RLS信号强度与核酸的浓度呈线性19。 刘绍璞等研究了 5种阳离子表面活性剂与核酸反应的 RLS光谱20。陈展光等首 次利用诺氟沙星做为RLS光谱探针，测定了叶绿体脱氧核糖核酸（ctDNA） 0在的 XRWn代山计缓冲溶液中，波长nm处出现最大RLS峰，ctDNA的线性 响应

9、范围为1 g - ml-1 ,检测限为ng - ml-1。还合成了希夫碱试剂三已（:邻羟基苯基亚甲氨基）乙基）胺，并且研究了其与核酸在盐酸介质中的反 应。对希夫碱剂三（2 （:邻羟基苯基亚甲氨基）乙基）胺）岫 体系的研究发现，在处增加的RLS强度与核酸的浓度成线性关系（ctDNA,仙g ml-1;fsDNA , N g - mL1）。ctDNA的检测限是 ng - mL1 , fsDNA的检测限是 ng - mL1。结果 与紫外可见分光光度法测得结果一致21。林枫等研究在介质中加入DNAK 阳离子表面活性剂可使二甲酚橙的 RLS增强，据此建立了以二甲酚橙为分子探针 测定DNAB分析方法，适用于

10、合成样品中的 DNAW定22。2在化学药分析中的应用黄承志等利用具有双亲性的RhBCTWAB全内反射共振光散射法测定肝素，肝素通过与 RhB和CTMABI互作用 形成三元双亲性的复合物RhB肝素C1BR,而被RhB和CTMAB、同吸附在水/ 四氯化碳（H2O/CCl4）界面上，引起强烈的TTR RLS增强信号用于肝素的测定 19。陈展光等在氧氟沙星茜素紫3B体系中发现，的BR缓冲溶液中，在nm处，Ngml-1范围内的氧氟沙星与增加的 RLS强度成线性关系。与此同时， 在，nm处，n g ml-1范围内的氧氟沙星与RLS强度成线性关系，检测限分 别为pg - ml-1 , n g ml-121。

11、氧氟沙星 茜素紫3B体系可用于人体的氧 氟沙星血药浓度测定。还建立了人血清中抗菌类四季俊化合物的 RLS技术检测方 法23。陈展光等，建立的二澳羟基苯基荧光酮。用HW 曲通仃川力工100 舟的共振光散射光谱新体系，分析测定了中药、头发以及水中的微量钥21 o刘 云富等研究发现在硫酸介质中，神舟杂多酸与碱性染料RhB缔合导致RhB体系的 RLS强度减弱，在一定浓度范围内，种（V）的含量与体系减弱的RLS强度成线性 关系，据此建立了 RLS技术测定神（V）的新方法24。3在中药分析中的应用黄承志等，研究了荧光素（臼匕）小集碱（BE）全内反射共振光散射法测定小 集碱。采用TTR RLS技术通过Flu

12、与BE在水/1,2,二氯乙烷（H2O/DCE界面反应 研究了 BE在界面上的特性。Flu与BE形成双亲性的复合物，在 H2O/DC/面富 集，并引起强烈增加的TTR RLS信号，最大吸收波长位于nm,所得信号强度在 一定范围内与BE浓度成正比关系，检测限为 ng mL1。本方法与药典使用的 HPLCT法对照灵敏度有所提高19。张忆华等，在pH为的Tris缓冲溶液中建 立了绿原酸 CTMAE 体系，实验表明，nm处增强的RLS光强度（AIRLS） 稳定，在pgmL-1的浓度范围内，体系 AIRLS与ctDNA的浓度具有良好的 线性关系，检测限为ng - mL1o在厚朴酚 仃肺 clDA体系中，选

13、择pH值 为的Tris缓冲溶液来控制反应体系的酸度，nm作为定量分析的波长。在 pg mL1的浓度范围内，AIRLS与ctDNA的浓度具有良好的线性关系。在最佳 反应条件，nm处，时，儿茶素 CTVIAB ClDA体系在g - mL-1的浓度范 围内，AIRLS与ctDNA的浓度成线性关系。类似的实验还有山奈酚CTVIAB clDA体系。止匕外，张忆华还研究了三价稀土离子与奥皮素、山奈酚 所形成的络合物的RLS光谱，研究了 ctDNA对它的淬灭作用。建立了 Th3+/E3- 能皮素岫体系以及Ib3+./Eu?+山奈酚 MDNA体系，结果表明，柳皮素 与山奈酚通过配位作用与Tb3+/Eu3+结合

14、，引起体系RLS光强度的增力口，而当加 入ctDNA后，体系的RLS光强度降低，原因是ctDNA结构中的磷酸骨架可以与 Tb3+和Eu3侬生螯合作用，导致溶液中ctDNA和山奈酚与Tb3+/Eu3+的竞争配位。 该方法取得了明显的实验成果25。4结语由于RLS技术是建立在普通光谱法基础上，分析结果虽然是物质的散射光 谱信息，但物质形态特征等却不能被获取。基于此问题，一种结合显微成像技术的共振光散射成像技术被建立起来，对生物大分子的聚集形态进行了深入的研究 和探讨26,仪器的性能和工作条件对所获信号影响大。由于RLS光谱在较大光谱通带下获得，因而不利于光谱精细结构的研究。虽然我们知道散射光强度与

15、散 射粒子浓度有关，但出发点是从同步光谱开始的，显然其测定公式推导并未涉及 RLS的散射本质。因此，用于分析化学的RLS技术原理与定量基础尚未有定论。虽然RLS技术作为一种新兴的分析测定技术存在一些不足，但随着RLS技术理论 和应用上研究的深入，使RLS技术不断朝着痕量、高效、微观和自动化方向发展， 极大地提高了 RLS技术分析法的灵敏度，选择性和特异性，应用领域不断扩大。 已报道的有关药物的RLS分析方法主要涉及如下药物：肝素27、地唾氯俊23、 盐酸小集碱28、多糖29、产丁 30、氨基糖甘抗生素31、青霉素32等。 除了一些常规的测定药物的 RLS方法之外，近几年还发展了以下几种方法12

16、: RLS成像技术、FTA RLS技术、双波长比率RLS技术等。RLS技术以其更灵敏、 更方便，不需要荧光物质的特定体系等优势，必将更好地为药物分析测试服务。【参考文献】PASTERNACK R F,COLLINGS P J. Resonance light scattering: A new technique for studying chromophore aggregationJ. Science,1995,269: 935-9.HUANG C 乙LI K A,TONG S Y. Determination of nucleic acids by aresonance - ight s

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