免疫学技术实验指导

1、免疫学实验须知本课程是以实验为主的综合技术性课程，旨在提高和发掘的创造性思维及实验操作能力，培养求实、创新的科学作风。通过实验教学力求使严谨、严肃、掌握免疫学技术的基本原理、基本方法与基本操作。为此，对所有参加本课程的同学特要求如下：1 参加本课程学习的同学，在每次实验前务必认真预习本实验指导，对实验的原理、操作方法和实验用的器材、试剂以及预期的实验结果必须做到“心中有数”。2 参加本课程学习的同学，在进入时应自觉穿好衣，保持环境的安静和整洁，遵守课堂秩序。3 参加本课程学习的同学，在实验过程中必须爱护实验器材与设备，节约实验试剂。使用贵重仪器时应该获得指导教师的和指导。如遇器材损坏或其它意外

2、情况应及告指导教师。4 参加本课程学习的同学，在实验完成后必须按照指导老师的要求，废弃物。、整理好实验器具，并按要求妥善处理各类实验5 参加本课程学习的同学，在实验完成后应按照指导老师的要求，本着实事求是的科学精神，详尽完成实验，并能对实验结果做出一定的分析与。目录第一章实验一实验二第二章实验三实验四实验五第三章实验六实验七实验八第四章实验九实验十抗原获取与抗体的.3免疫球蛋白的分离与纯化4动物免疫与佐剂.6体外抗原抗体反应及其应用8凝集抑制试验妊娠试验9双向琼脂扩散试验免疫球蛋白鉴定10免疫电泳免疫球蛋白鉴定11免疫标记技术12荧光抗体标记13酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法 .1

3、4酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法16免疫细胞的检测17外周血单个核细胞的分离密度梯度离心法18外周血 T 细胞的数量检测E-花环形成试验20实验十一实验十二毒试验实验十三淋巴细胞表面抗原检测免疫荧光法22细胞膜表面抗原检测补体依赖的微量淋巴细胞23NK 细胞功能检测25第五章细胞因子检测26实验十四 肿瘤坏死因子检测27附录：免疫学技术实验常用试剂配方29第一章 抗原获取与抗体的在以抗原和抗体的特异性结合为基础的免疫学应用技术中，抗原的获取与抗体了免疫应用技术的重要基础。在经典的免疫学技术中，抗原的获取通常是指从复杂的有机体或多种混合组分的中分离出特定的抗原成分，以使被免疫机体的免疫应答

4、局限化，提高反应的特异性。在此过程中通常使用的技术包括了组织分离与破碎、离心技术、各种层析以及以盐析为代表的多种选择性沉淀技术。而在以半抗原到载体联接等生化反应技术。免疫原的过程中，则还需涉及在经典的抗体过程中，通常以免疫动物作为多克隆抗体的有效途径。这一过程牵涉到如何选择动物，怎样进行免疫接种和佐剂的使用等问题。而在现代免疫学技术中以杂交瘤技术单克隆抗体，则更要依赖于细胞培养、细胞融合、选择性培养和克隆化技术等许多实验方法。因此，在抗原的获取与抗体的这一章中，牵涉到了许多有关生物化学、免疫学以及细胞生物学的技术。而掌握这些技术除了需要的学习外，更需要反复的实践。本章实验由于时间与各种条件的限

5、制，仅能向提供一个基本的概貌和一些力所能及的实验操作，希望通过理论与方法的介绍和初步的实验操作，能举一反三，完成如下的学：1 掌握抗原纯化的目的意义及各类免疫原的原则。2 掌握单克隆抗体与纯化的一般过程及方法原理。3 掌握杂交瘤技术的基本原理熟悉特异性抗体的熟悉佐剂的原理与过程6 了解免疫动物的基本方法及注意事项实验一免疫球蛋白的分离与纯化一、原理盐析法：利用蛋白质的胶体性质，在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐类（如 (NH4)2SO4、Na2SO4 等），使蛋白质脱水及降低颗粒表面电势，溶解度随之降低，使蛋白质从溶液中析出，此即称为盐析作用。不同浓度的中性盐可分别将不同蛋白质组分析出，达到分离

6、之目的。沉淀（免疫）球蛋白的硫酸铵的最适饱和度为 33%。凝胶过滤法：凝是以多孔网状结构凝胶作层析介质。凝胶具有海绵状立体网孔结构，孔径较一致，犹如分子筛，故本法又有分子筛层析法之称。当不同大小分子的混合物加至柱表面时，大分子物质不能进入胶粒的网，在胶粒之间的空隙中向下移动，首先被洗脱，而小分子物质则进入胶粒的网而反复受阻，向下移动速度慢而后被洗脱，因而使混合物中分子大小不同物质顺序流出柱外，达到分离不同大小分子混合物的目的。二、器材与试剂1器材磁力搅拌器、铁立架、蝴蝶夹、层析柱、离心机、紫外分光光度计试管、烧杯、滴管、吸管、透析袋、烧瓶、洗耳球（3） 座标纸、记号笔、橡皮筋、2试剂正常葡聚糖

7、凝胶（Seadex G-75）饱和硫酸铵（ 7.8）、生理盐水试纸（4）8.0，0.005M 磷酸缓冲液（5） FITC+Blue DEXTRAN 2000 混合物三、操作步骤【盐析法】1ml 正常在稀释加等量生理盐水稀释，混匀。内逐滴加入 2ml 饱和硫酸铵溶液，边滴边搅拌，使其充分混匀，直至加完（此时硫酸铵饱和浓度为 50%），然后置 4冰箱 30 分钟，使蛋白质充分沉淀。将上述样品离心（3000rpm）15 分钟，弃去上清夜。沉淀物用少量生理盐水（约 2ml）溶解，然后逐滴加入饱和硫酸铵溶液 1ml（此时硫酸铵饱和浓度为 33%），然后置 4冰箱 30 分钟，使其沉淀。将沉淀样品离心（3

8、000rpm）15 分钟，弃去上清夜。沉淀物用少量生理盐水（约 1.5-2ml）溶解。7 将上述溶解后的样品装入透析袋并扎紧，自来水冲洗透析 40 分钟，然后置生理盐水中透析（放冰箱）至无 NH4+存在为止（用奈氏试剂滴入透析液中，无黄色沉淀出现即可），此样品即为粗制免疫球蛋白。【凝胶过滤法】1 将玻璃层析柱垂直于铁立架上，内加入约 1/3 柱高的8.0，0.005M PB缓冲液，赶尽内的气泡，关紧止水夹。2 将经过缓冲液平衡过的Seadex G-75 凝胶轻轻搅匀，沿管壁缓缓加满层析柱，待凝胶下沉压积约 1 高度时打开止水夹，控制流速为 2030 滴/分。3 将凝胶不断搅匀加入层析柱，直至凝

9、胶沉积面离管口 45 为止。4 接上8.0，0.005M PB 洗脱缓冲液，流穿层析柱平衡 45 分钟。5 将样品上柱，洗脱（注意控制流速 20 滴/分），观察分层情况，收集先流下的Blue DEXTRAN。四、操作注意事项1 盐析时注意需将饱和硫酸铵逐滴加入稀释内，并迅速摇匀。注意区别前后两次盐析所加的饱和硫酸铵含量。注意装柱时的正确操作，检查层析柱是否均匀，有无气泡、裂隙，凝胶沉积面是否平整。上样、洗脱时应做到“前切”、“后切”。“前切”指柱顶缓冲液于凝胶平面相切时再加样品；“后切”指待样品走至于凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。五、实验结果与分析实验二动物免疫与佐剂一、原理以特定抗原免疫动

10、物，经多次增强免疫后，可从动物中获得特异性抗体。此种免疫应答在有佐剂参与的情况下到大幅度增强。目前常用的佐剂为福氏完全佐剂，是由石蜡油、羊毛脂与卡介苗组成的油包水乳液。被免疫的动物，其免疫注射部位的淋可因免疫应答反应而明显肿大。解剖动物淋切片中可观察到初级淋巴滤泡转化成次级淋巴滤泡，有生发中心生成。若将淋二、器材与试剂 1器材内细胞制成涂片，染色后可观察到淋巴母细胞的存在。小烧杯、搅拌器、磁珠、OT 注射器、4 号针头动物解剖板、眼科镊子、眼科剪刀、载玻片显微镜2试剂（1）石蜡油、羊毛脂、卡介苗（2）牛（3）H白蛋白s 液瑞氏染液小鼠、免疫一周后小鼠三、操作步骤（一）含佐剂抗原的称取 10g

11、羊毛脂加入 40ml 石蜡油，15 磅 15 分钟高压。取上述混合液 10ml 至烧杯内，加入卡介苗一支混匀。取上述混合液 10ml 放入另一烧杯内，加搅拌珠在搅拌器上搅拌，同时取牛血清白蛋白（抗原）1ml 逐滴加入烧杯内，搅至混合物成白色油包水乳液为止。（二）免疫动物将已制成的含佐剂抗原吸入OT 注射器。取小鼠固定于解剖板，分别在鼠尾根部上方 1 处与右足底趾间皮下注射4050l 含佐剂抗原。（三）免疫后动物淋观察取另一免疫一周后小鼠处死，并固定于动物解剖板上。从腹正中剪开小鼠皮肤，固定于两侧，寻找肿大的皿中。淋，并取出置平8 将腘窝处皮肤剪开，在腘窝软组织中寻找肿大淋，取出置中。打开腹腔将

12、内脏推向上方，在腹主动脉两侧寻找腹腔淋观察淋的大小、形态。，取出置中。11将淋剪成两半，用小镊子在干净载玻片上作涂片。12待涂片干燥后，用瑞氏染液染色后在显微镜下观察。四、操作注意事项1 免疫小鼠时应注意避开。2 注射时，应掌握好抗原剂量。3 取出腹主动脉两侧淋时，应注意避免损伤，影响手术视野。五、实验结果1 含佐剂抗原的与分析取一滴好的抗原滴在水面上，观察其扩散情况，以不马上扩散、不和水混合的状态为油包水乳液，表示该抗原符合标准。2 免疫动物判断注射的抗原是否进入皮下，观察并描述鼠尾根部及足底趾间注射局部的形态。3淋观察比较左右腘窝淋的大小及形态。从淋涂片中寻找淋巴母细胞并描述。第二章 体外

13、抗原抗体反应及其应用体外的抗原抗体反应在经典的学反应中主要包括凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应和中和反应四大类。这些反应主要利用了抗原抗体特异结合的原理以及抗原抗体结合的合适比例理论，使抗原抗体复合物在某些特定条件下能被肉眼所观察到。其中尤以凝集反应与沉淀反应最为经典和常用。凝集反应是指颗粒性抗原与相应抗体混合时，给予适当条件则可出现大小不等凝集块的现象。依据这一现象所设计的凝集试验，可分为两大类：一类是颗粒性抗原与抗体直接反应叫做直接凝集试验；另一类则是将可溶性抗原事先吸附于颗粒载体表面，制成致敏载体颗粒，再与相应抗体反应，称为间接凝集试验。沉淀反应则是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在

14、的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀试验主要包括絮状沉淀试验、环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验三大类。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为扩散试验和电泳技术两类。在一些实验设计中穿插了这两类技术，不同的实验类型。了许多种经典的学反应通常用于抗原抗体的定性、定量测定，以及对抗原抗体成分的分析、比较与鉴定。这些试验具有操作简单、实用，结果容易观察等优点，但其灵敏度和分辨性常受到方法自身的限制。本章实验内容是一些最为经典的凝集与沉淀试验，希望相应的理论学习能完成下列要求：1 掌握体外抗原抗体反应的特点及影响通过这些实验与2 掌握各类经典的学反应的基本概念与实验原理3 熟悉

15、常用的凝集、沉淀试验的方法与结果分析4 了解学反应的一般应用实验三凝集抑制试验妊娠试验一、原理聚苯乙烯乳胶颗粒具有吸附蛋白质类生物高分子的性能。利用它作为载体，直接吸附抗原（如绒毛膜促激素，HCG）成为致敏乳胶颗粒。将抗体先与标本中的抗原结合，然后再加入致敏乳胶颗粒，如不出现凝集现象，说明标本中的抗原中和了抗体，结果为阳性；若标本中无抗原物质，则抗体与加入的致敏乳胶颗粒结合，出现凝集，结果为速、简便、准确等优点。二、器材与试剂1器材。此法作为早期妊娠的有效方法，具有快（1）载玻片（2）50l 微量移液器（3）移液头（4）牙签（5）黑纸2试剂致敏HCG 乳胶试剂抗 HCG 抗体孕妇尿正常尿 三、

16、操作步骤取载玻片二块，一块加孕妇尿 50l，另一块加正常尿 50l。各加一滴抗 HCG 抗体，用牙签搅动，使其充分混匀，均匀分布于载玻片上。再加致敏HCG 乳胶抗原一滴，轻轻摇动 35 分钟，在较强的光线下、黑纸背景上，边摇动边观察结果。4：出现均匀一致的细小凝集颗粒。阳性：仍现乳状液体，无凝集颗粒。四、操作注意事项几种试剂的加入顺序，应照操作步骤进行，否则结果难以判断。所用搅拌的牙签应注意一头只能搅拌一个标本。本试验一般作定性测定，液滴大小应均匀一致。五、实验结果与分析试描述不同标本出现的凝集状态，并判断、阳性结果。实验四、原理双向琼脂扩散试验免疫球蛋白鉴定将抗原和抗体分别加到琼脂凝胶板上的

17、小，使两者相互方扩散，经一定时间后，若两者特异性结合，在琼脂二、器材与试剂1器材形成白色沉淀线。（1）载玻片（2）定量吸管（3）打孔器和图形卡（4）毛细管（5）有盖搪瓷湿盒（6）吸耳球（7）煮沸水浴箱2试剂（1）1.2琼脂（2）生理盐水（3）抗原（4）抗体三、操作步骤1 用定量吸管吸取热琼脂 3.5ml，平铺于载玻片上。2 待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑去琼脂。3 在 100l Ab1 中加入 100l 生理盐水，依次稀释成 1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64 等不同滴度。并用微量移液器分别加 10l 于周围。4 用微量移液器将抗原加 10l 于孔。5 将玻片置于有

18、盖搪瓷湿盒内，隔天观察结果，绘出沉淀线位置、数量、形态。四、操作注意事项浇载玻片时，琼脂面尽量要铺平。加样时应一次加满每个孔，并防止样品溢出孔外。五、实验结果画出各与分析的沉淀线位置、数量、形态，并予以简要的说明。实验五免疫电泳免疫球蛋白鉴定一、原理免疫电泳是将电泳与双向琼脂扩散相结合的一种抗原分析方法。根据抗原中各蛋白质组分的电荷和分子量大小不同，在电场作用下有不同的迁移率，从而可将混合物中各种不同组分分开。实验时，将被检抗原样品先放在琼脂板的小进行电泳分离，再在其平行方向开槽，加入已知抗体，进行双向扩散。当相应抗原、抗体比例合适时，即形成白色沉淀弧，根据沉淀弧的数量、位置和形态，即可分析样

19、品中所含的抗原成分及其性质。二、器材与试剂1器材电泳仪、电泳槽打孔器、挖槽刀和图形卡载玻片、定量吸管和吸耳球毛细管有盖搪瓷湿盒煮沸水浴箱2试剂（1）1.2琼脂凝胶（2）生理盐水（3）抗原（4）抗体（5）8.6, 0.05M妥缓冲液（三）操作步骤：1 用定量吸管吸取热琼脂 3.5ml，平铺于载玻片上。待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑去琼脂。2 用毛细管将抗原（）加入小，将琼脂板放入8.6, 0.05M妥缓冲液的电泳槽中，两端用四层纱布搭桥，电泳时电压可调至 110V，电泳 4560分钟。3 从电泳槽中取出琼脂板片按图在两孔之间挖一小槽，用针挑去槽内琼脂，在槽内加入抗抗全抗体。4 将载玻片

20、置于搪瓷湿盒内，进行扩散 2448 小时后观察结果。四、操作注意事项浇载玻片时，琼脂面要尽量铺平。加样时应一次加满，并防止样品溢出孔外。五、实验结果画出各与分析的沉淀线位置、数量、形态，并予以简要的说明。第三章 免疫标记技术免疫标记技术是目前应用极为广泛的一门检测技术，它在检测的特异性、敏感性与快速性上，以及对抗原、抗体的定量、定性、定位检测方面较之经典的血清学反应都有很大的进步与提高。这一技术是以特异性的抗原、抗体分子与一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质相结合，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性质与含量。常用的标记物包括了荧光素、酶和放射性核素等。用这三种标记物进

21、行标记的免疫检测技术被称作三大免疫标记技术。随着应用于不同目的、不同材料和不同检测方法的实验类型不断涌现，这些标记技术又派生出了许许多多的各种实验类型。同时，人们也在不断地发掘与开发利用的标记物质来推动免疫标记技术的发展。在免疫标记技术的应用中，其技术内容主要包括了两大方面：一是标记物与抗原、抗体的连接技术；二是标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理以及相应的检测仪器的使用方法。目前，经常应用的免疫标记技术的实验类型主要有荧光标记技术、放射免疫测定和酶联免疫吸附试验等。它们所涉及的主要是标记物与抗原、抗体的结合方法、该项检测实验的设计原理以及各类检测设备，如荧光显微镜、-液闪仪、酶标仪

22、等的使用原理和方法。本章实验以此为主干向大家介绍与荧光标记技术和酶标记技术为主的有关实验，希望通过这些实验和相应的理论学习能够达到如下的学1掌握免疫标记技术的基本原理。：掌握三大免疫标记技术的工作原理及主要实验类型的原理和方法。熟悉荧光标记的结合技术与 ELISA 试验的实验设计原理。了解免疫标记技术的应用与发展。实验六荧光抗体标记、原理荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合，形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明亮的特异荧光。实验中常用异硫 基荧光黄（fluore

23、scein isothiocyanate, FITC）作为标记物，在碱性溶液中，FITC 上的化学基团异硫 基（-N=C=S）与抗体蛋白氨基（主要是赖氨酸的 -氨基）结合，形成荧光抗体。二、器材与试剂1器材（1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、紫外分光光度计（2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、2试剂试纸、黑纸（1）抗体（2）异硫 基荧光黄（FITC）（3）葡聚糖凝胶（Seadex G-25）（4）9.5，0. 5M 碳酸缓冲液（4） 7.0，0.005M 磷酸缓冲液三、操作步骤1.取已知浓度的抗体蛋白溶液，用9.5，0. 5M 碳酸缓冲液稀释至最终浓度为20mg/ml。置于包黑

24、纸的小烧杯中，并放入磁棒。称取适量 FITC：按 FITC(mg)/抗体蛋白(mg)的质量比为 1/100，并计算出需要 FITC 的量。即：FITC 的量(mg)=待标记抗体蛋白总量(mg)0.01。将称好的 FITC 放在试管中，并用黑纸包好，然后取相当于稀释后抗体蛋白溶2.3.液体积 1/10 的9.5，0. 5M 碳酸缓冲液溶解 FITC。4.开启搅拌器，将 FITC 溶液用滴管逐滴滴入含抗体蛋白溶液的烧杯内，加完后用试纸测试，如低于 9.5，则用碳酸缓冲液调整至 9.5，加盖搅拌 1小时。用 Seadex G-25 装层析柱，用将上述标记液上Seadex 柱。5.6.7.8.7.0，

25、0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱。用7.0，0.005M PB 洗脱，流速控制为 1ml/分钟。用三支试管收集：待黄绿色荧光走至离下端 2cm 处时，用第一支试管开始收集；当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用第二支试管收集全部黄绿色荧光溶液，待黄色荧光溶液在流出层析柱口时，换用第三支试管收集，直至流出液黄色消失，则停止收集。四、操作注意事项1.2.3.严格掌握整个反应体系中的抗体蛋白含量，可提高标记效率。装柱及上样操作参照实验一。最后洗脱时应注意掌握洗脱速度及每管收集量。五、实验结果与分析收集管的 OD495 读数与OD280 读数，根据公式：F/P= 2.87OD495(读数) OD280

26、(读数)0.35OD495 (读数)计算 F/P 值，并对该比值作一简单分析。实验七一、原理酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。在本实验中，（1）用已知抗体固相载体；（2）加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合；（3）加

27、入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。二、器材与试剂1器材：（1）50250l 可调微量移液器与移液头（2）37培养箱、搪瓷盒（3）酶标（4）洗瓶（含洗涤液）、吸水毛巾（5）酶标检测仪2试剂：架（1）已抗体的酶标条（2）400g/L 抗原溶液（3）抗原稀释液（4）待测标本 1、2（5）酶标抗体（6）洗涤液（三、操作步骤7.2PBS-Tn 20）（7）底物 A、B 溶液（8）终止液1 取已抗体的酶标板，分别在第 16 孔各加入抗原稀释液 100 ul，第 6、7孔各加入 400g/L 抗原溶液 100 u

28、l，从第 62 孔进行对倍稀释（最后在第 2 孔吸出的 100 ul 弃去）；在第 8、9 孔各加入 100 ul 待测标本 1；在第 10、11 孔各加入 100 ul 待测标本 2。置酶标板于 37，保温 30 分钟。弃去述弃去液体，以洗涤液注满，置 3 分钟后甩干液体，重复 3 遍。上再加入酶标抗体 100ul。置 37，保温 30 分钟。液体，以洗涤液注满，置 3 分钟后甩干液体，重复 4 遍。4 各孔均加底物 A 和底物 B 溶液各 100ul，混匀。置 37，10 分钟左右加入终止液 50ul 中止反应。5 将酶标板置酶标仪上比色，以第 1值）。零，在 450nm 波长处光密度值（

29、O.D6 结果判断：以 O.D 值为纵坐标，抗原标准浓度（0;12.5;25;50;100;200;400g/L）为横坐标在半对数坐标纸上画出标准曲线，再根据样品的平均 O.D 值在标准曲线上查出各自的含量。四、操作注意事项1 正确掌握微量移液器的使用方法：吸液时将按钮按至第一止点，排液时则应尽力按足按钮（至第二止点）。2 酶标板的正确洗涤：加洗涤液时应，勿使洗涤液溢出，流入周围，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干弃去。残液。洗涤液加入，须保持三分钟再3 注意加样顺序，加样品时应注意从最高稀释度逐一加至最低稀释度。五、实验结果与分析实验八一、原理酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法酶联免疫吸附试验

30、（ELISA）是检测溶液中抗原或抗体的特异而灵敏的免疫学检测方法。间接法是常用的一种检测抗原的方法，其原理为：（1）已知抗原结合于固相载体表面而不失其活性；（2）加入受检的标本（含相应抗体）使之与结合在固相上的抗原组成抗原抗体复合物；（3）加入酶标记的第二抗体，使之与第一抗体结合。然后加入相应底物，在酶作用下催化底物呈显色反应。根据颜色反应的强弱可对受检标本进行定性、定量测定。二、器材与试剂1器材：（1）酶标检测仪（2）37培养箱（3）微量移液器、移液头（4）烧杯（5）试管（6）滴管2试剂：（1）已抗原的酶标板受检标本（阴、阳性对照；待测标本）酶标第二抗体（4）洗涤液（7.2PBS-Tn 20

31、）底物A 溶液：四甲基联苯胺，TMB底物A 溶液：0.3% 双氧水终止液：2M 硫酸三、操作步骤1.取出酶标条，放在架子上。其余部分放回袋，密封放 4保存，用洗涤液注满各孔，置片刻，甩干，如此洗涤一次。2.加标本：按下列排列于各分别加样 100ul。将板条放入 37水浴箱中温浴。温浴 1 小时后取出，弃去液体，用洗涤液洗涤 3 次。甩干。然后在每加入相应的酶标抗体二滴。3.4.5.37水浴箱温浴 1 小时后取出，弃去液体，用洗涤液洗 5 次。方法同上。洗涤完毕后每加入底物A 底物 B 各二滴，置室温 1015 分钟。每孔再加终止液一滴终止反应。 四、操作注意事项（见实验七）五、实验结果1 以空

32、白对照OD 值与分析零。在波长 450nm 处各孔的光密度值（OD 值），凡样品对照孔均数 2 倍（对照孔 OD 值均数0.150 则以 0.150计），该样品即为阳性。123456789对照对照阳性对照阳性对照样品 1样品 1样品 2样品 2稀释液空白对照第四章 免疫细胞的检测免疫细胞的检测技术是近代免疫学探索机体免疫系统奥秘的一把不可或缺的。在长期的科学研究工作中形成的免疫细胞检测技术主要包括两个部分，即对免疫细胞表面蛋白分子的检测和对各类免疫细胞功能的测定。此外，从实验研究需要出发，也建立起了许多分离细胞的技术。免疫细胞表面蛋白分子的检测，是对免疫细胞分类、定量的重要依据。目前的检测技术

33、主要依靠以抗原抗体特异结合原理为基础的膜抗原识别检测，如荧光抗体技术、酶标抗体技术以及补体依赖的细胞毒试验等。对一些特殊的膜蛋白也可用特殊的配体来加以检测，例如花环形成试验等。各类免疫细胞的功能检测试验中包括淋巴细胞转化试验、特异性与非特异性细胞毒试验、抗体形成细胞的检测试验以及细胞吞噬能力和胞内能力的功能检测。由于这些试验都需以特定细胞群体为试验对象，因此，随之派生了许多细胞分离方法，常见的有密度梯度离心分离技术、尼龙毛分离技术等。本章实验介绍了一些较经典的免疫细胞检测试验供一个全面的了解，并希望由此达到下列教学要求。掌握免疫细胞的各种分离技术的原理。掌握免疫细胞表面蛋白检测的主要技术类型和

34、原理。熟悉免疫细胞功能检测的方法和原理。了解免疫细胞表面标志检测方法的应用。了解免疫细胞功能检测的方法的应用。对这一检测技术有实验九一、原理外周血单个核细胞的分离密度梯度离心法根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定的液体界面，将外周血中各种不同的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的1.090。因此，若用大1.0751.090 之间，而红细胞与粒细胞的均大于为 1.0770.001 的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。二、器材与试剂1器材：（1）水平式离心

35、机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸2试剂：（1）抗凝全血（临时抽取）、40 倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，：1.0770.001）（3）Hs 液（4）白细胞稀释液（5）0.5%生理盐水溶液三、操作步骤1.在已含 1ml 抗凝全血的试管内加入 1ml Hs 液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有 1ml 淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20 分钟。用计数板在显微镜下计数 40 倍稀释的全血，计算出其中的白细胞总数

36、（/ml）及单个核细胞总数（/ml）。离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图：2.3.4.5.用滴管地直接白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入刻度离心管内。在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入 H6.s 液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（1000rpm）10 分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hs 液洗涤 2 次。7.8.用 0.5ml Hs 液将沉淀细胞稀释，摇匀。取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出白细胞总数（/ml）及单个核细胞数（/ml）。9.检查细胞：取细胞悬液一滴加入等量溶液于另一试管中充分混匀

37、，用载玻片在显微镜下计数 100200 个单个核细胞中四、操作注意事项的死细胞数。1.2.注意分离液与稀释血的比例，一般以 1:21:3 为宜。分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。3.4.加入稀释血时应十分，注意保护试管内的界面，勿使影响分离效果。做细胞低。检查时，染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞可能降五、实验结果与分析通过前后两次细胞计数：计算细胞回收率（%）分离后单个核细胞总数1.100%分离前单个核细胞总数计算单个核细胞纯度（%）分离后单个核细胞总数2.100%分离后白细胞总数3.计算细胞（%）分离后活细胞数100%分离后细胞总数实验十一、原

38、理外周血T 细胞的数量检测E-花环形成试验T 淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）的受体，即 CD2。当其细胞膜与绵羊红细胞相接触时，通过粘附作用，可使SRBC 粘附于 T 细胞周围，形成玫瑰花样的形状，故称为 E-花环（Erythrocyte-Rosette），此法可作为特异性检测 T 淋巴细胞的方法。临床以此作为机体免疫功能、免疫状态以及判断预后、观察药物疗效的指标。二、器材与试剂1.器材：（1）刻度离心管、试管、滴管、橡皮滴头、定量移液器、洗耳球（2）4冰箱、37水浴箱、离心机、显微镜载玻片、盖玻片小滤纸、擦镜纸2.试剂：（1）抗凝全血（临时抽取）（2）淋巴细胞分离液（市售，：1.07

39、70.001）（3）Hs 液（4）1% AET SRBC 悬液（5）10% FCS-1640 培养液（6）0.2%美兰水溶液三、操作步骤1.2.抗凝全血 2ml，加 2ml Hs 液稀释。用滴管将此稀释全血沿盛有 2ml 淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20 分钟。3.4.用滴管地直接白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入刻度离心管内。在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入 H5.s 液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，离心（1000rpm）10 分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，在用足量 Hs液洗涤一次。用 0.7ml 10%

40、 FCS-1640 培养液将沉淀细胞稀释，摇匀（此时细胞浓度约为 2106/ml，在操作过程中应注意淋巴细胞回收率、纯度及细胞）。将淋巴细胞悬液与羊红细胞悬液等体积混合，加入试管中摇匀。将上述混合悬液置 37水浴箱温育有 15 分钟，每 5 分钟摇匀一次。取出后低速离心（500rpm）5 分钟。6.7.8.9.放入 4冰箱 45 分钟。制片镜检：从冰箱取出后吸出部分上清液，轻轻摇动试管，使细胞重新悬浮，吸出一滴置于载玻片上，同时吸一滴染液于细胞悬液上，盖上盖玻片，直接在显微镜下观察。除直接镜检外，也可制片染色观察：吸一滴细胞悬液于载玻片上，推平、晾干、用无水固定 3 分钟，然后放入染色缸，使其

41、作用 1015 分钟，取出冲洗、晾干，显微镜下观察。四、操作注意事项分离细胞注意事项见实验九。计数及摇匀细胞时动作轻柔，避免打散已形成的花环。五、实验结果与分析观察花环形成细胞：淋巴细胞周围有三个以上绵羊红细胞的即为一个花环形成细胞。计数玻片中几个视野的淋巴细胞总数和花环形成细胞总数，计算其花环形成率，并推测其 T 细胞百分率。实验十一 淋巴细胞表面抗原检测免疫荧光法一、原理荧光素标记的特异性抗体与淋巴细胞表面相应抗原结合，使淋巴细胞带有荧光素，在一定波长的激发光作用下产生荧光，可用流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。流式细胞仪的基本原理：将细胞形成高速细流而从喷嘴逐个流出，经激发光照射后产生的荧

42、光信号等由感光元件探测，通过计算机自动处理各种数据，可以测得每个细胞的荧光强度、细胞大小等物理特征。二、器材与试剂1.器材（1） 10ml 圆底试管，FACs（2） 血球记数板，盖玻片（3） 4冰箱，离心机，流式细胞仪2.试剂离心管，滴管，吸管（1） 抗凝全巴细胞分离液荧光素标记抗体FACs 缓冲液（4） Hs 液三、操作步骤1.2.抗凝全血 2ml，加 Hs 液 2ml 稀释。取淋巴细胞分离液 2ml 置 10ml 试管，用滴管将稀释全血沿管壁液界面上。于水平式离心机中离心 2000rpm，20 分钟。用滴管吸取界面白色细胞层，移入尖底离心管中。铺于分离3.4.5.加入足量 Hs 液，充分混

43、匀后离心 1000rpm，10 分钟，离心后弃上清液，将试管底部细胞充分叩匀，再用 Hs 液洗涤 1 遍。6.加 1ml Hs 液重悬浮细胞，计数后取 1106 细胞至 FACs试管，离心1500rpm，5 分钟，弃上清。叩散细胞后，加 0.1ml 荧光素标记抗体，震荡混匀，冰浴 30 分钟。加 FACs 缓冲液至足量，混匀，离心 1000rpm，10 分钟，弃上清，再重复用 FACs缓冲液洗涤 1 次。加 FACs 缓冲液 0.5ml 悬起细胞。流式细胞仪检测。7.8.9.10.附：全血法测 CD3、CD4、CD8 步骤：1.2.3.4.5.6.吸取抗凝全血 100l，加入含 5l 单抗混合

44、液的 1.5ml 离心管中；混匀，室温避光孵育 20 分钟；加溶血素 1ml，颠倒混匀，室温避光裂解红细胞 10 分钟；1500rpm/min 离心 5 分钟，弃去上清液；加 PBS 1ml，颠倒混匀，1500rpm/min 离心 5 分钟，弃去上清液；加 PBS 400l，颠倒混匀，移入 FACs检测检。四、操作注意事项分离淋巴细胞细胞注意事项见实验九。加荧光素标记抗体后的操作过程应注意避光，注意低温和保持细胞。五、实验结果及分析实验十二细胞膜表面抗原检测补体依赖的微量淋巴细胞毒试验一、原理抗体与淋巴细胞表面的膜抗原特异性结合后，免疫球蛋白的补体结合位点暴露。该抗原抗体复合物与补体结合而使其

45、活化，通过一系列级联反应，最终导致靶细胞的溶解胞内，而使细胞。由于死细胞膜通透性增加，可使（如、等）进入细。相反，。同时这些细胞也体积增大，折光性减弱、不能使活细胞染色，且活细胞折光性也无改变。通过光学显微镜的观察，可测得死细胞的百分率，以此来确定相应靶细胞上是否携带有特异性的膜抗原。二、器材与试剂1.器材：显微镜微量注射器、注射针头、细胞反应板（3）盖板、试管、滴管（4）擦镜纸2.试剂：（1）淋巴细胞悬液、抗淋巴细胞、补体（兔）（2）石蜡油、RPMI-1640 细胞培养液（市售）、细胞染色液三、操作步骤1.2.正确放置细胞反应板，轻轻倒入 10ml 石蜡油，避免气泡产生。按图在反应板上选好反

46、应孔与对照孔（甲组或乙组，每组 3-5 孔）。甲组对照孔乙组反应孔对照孔反应孔3.4.5.6.7.8.在对照各加入一滴培养液，反应各加入一滴抗体。混匀细胞悬液，在对照孔与反应室温（222）作用 30 分钟。各加入一滴细胞悬液，使其中液体混匀。每孔加入补体 3 滴，室温作用 4560 分钟。每孔加入细胞染色液 3 滴，染色 5 分钟。吸去盖板中的石蜡油与溶液，镜下观察并判断结果。四、操作注意事项（一）试剂要求1 补体：补体质量是影响实验结果的关键之一，一般采用新鲜的兔。每批补体使用前须测定是否存在天然细胞毒作用，应选用无细胞毒作用者。同时应测定补体的效价。2 靶细胞：根据实验目的选用相应的靶细胞

47、。要求所选用的细胞细胞数不大于 10%；细胞纯度高，尽可能少106/ml 为宜。靶细胞；细胞浓度合适，以 1.52.03 抗：应用前必须离心，去除杂质和脂肪的干扰。12345678910ABCDEF12345678910（二）反应条件1 时间：时间过长、过短都可能造成假或假阳性。2 温度：温度不宜过高或过低，两者均会影响实验结果。（三）加样操作加样时要注意将针尖石蜡油内，但不直接碰到，此即所谓“软加”。这样可避免试剂浮于油层表面，或使针尖沾上已加的样品而交叉污染。实验时，加样应遵循先加对照（四）染色与读数染色后，细胞不能用加反应孔的原则。固定，所有结果应在 6 小时内读完。五、实验结果1 观察

48、、与分析结果：按下表，各孔死细胞百分率。1234512345反应孔死细胞数（%）记分对照孔死细胞数（%）记分2 判别待检标本是否阳性：对照 CDC记分法，判别实验结果。意义（）死细胞百分数01011202140418081100记分124680可疑（）弱阳性（）阳性（）强阳性（）无效（O）实验十三 NK 细胞功能检测一、原理自然（NK）细胞是体内存在的一组重要的免疫细胞，主要对被的宿主细胞及肿瘤细胞产生自然作用。对 NK 细胞的功能的检测是免疫细胞效应功能检测的一个重要组成部分。目前对此类细胞毒作用的测定方法有多种类型，常用的主要是放射性核素法与酶法等几种。本实验主要介绍靶细胞乳酸脱氢酶（LD

49、H）法在测定 NK 细胞活性中的应用。LDH 是一种胞浆酶，正常情况下不能透过细胞膜，在细胞受损后，由于膜通透性改变可使 LDH 释出。根据 LDH释出后引起的级联酶促反应所形成的递氢体，使碘硝基氯化四氮唑（）还原成紫红色的甲臜类化合物，该物质在 490nm 处有一高吸收峰，故可通过酶标仪测定对显色反应进行定量。从而指示靶细胞的损害程度，间接反应 NK 细胞的生物活性。二、器材与试剂1.器材：酶标板、酶标仪、离心机试管、滴管、微量移液器、移液头2.试剂：（1）0.5% BSA-1640（2）1%NP-40（3）LDH 底物溶液（4）靶细胞悬液（K562 株，5104/ml）（5）NK 细胞悬液

50、（外周血单个核细胞，5105/ml）三、操作步骤1.按下表加入不同试剂，与细胞悬液分别制成测定组、自然组和最大组。靶细胞 100l 100l 100l效应细胞100l0.5% BSA-1640100l1%NP-40100l测定组自然最大组组2.将上述各组置于细胞培养板中，每组作三个复孔，充分混匀后置 37 CO2 培养箱培养 2 小时。取出培养板将细胞悬液移入试管中，加入 50l 预冷的 1640 培养液，离心（1000rpm）5 分钟。从各管中分别吸取 100l 上清液，放入酶标板中，再加入 100l LDH 底物溶液，混匀，置 3 分钟后加入 50l 1N HCl 终止反应。3.4.5.将

51、酶标板移至酶标仪上，在 490nm 波长下各孔的 OD 值。四、操作注意事项12细胞悬液时须保证细胞98%。细胞悬液时，应尽可能洗净培养液中含有的牛，以避免假阳性结果。3 操作时应充分混匀效应细胞与靶细胞，有助于 LDH 释出。五、实验结果与分析1各组三个复孔的OD 值，并计算出平均数。2 按下列公式算出标本NK 细胞的活性：测定组 OD 值自然组 OD 值NK 细胞活性（%）=100%最大组OD 值自然组OD 值第五章 细胞因子检测细胞因子是多种免疫细胞产生的一类具有重要生物学作用的调节与效应蛋白。机体内细胞因子含量与活性的变化通常可放映机体免疫系统的病理生理变化。因而，细胞因子检测成为近年

52、来兴起的一门较新的免疫学检测技术。由于细胞因子自身的生物学特性，使目前常用的检测方法分为三类，即生物学活性检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法。这三类检测方法各有其优缺点，在目前尚不能相互取代。本章实验以生物学活性检测方法为主，概要介绍有关细胞因子检测的最基本原理和方法，希望由此能完成以下的学：掌握现有的细胞因子检测技术的基本原理和方法类型。熟悉主要的生物学活性实验的原理和操作。了解细胞因子检测方法的应用。实验十四 肿瘤坏死因子检测一、原理将定量的靶细胞（如 L929 细胞株等）与含肿瘤坏死因子（TNF）的待检标本在一定条件下共同孵育一定时间，由于肿瘤坏死因子的细胞毒作用，造成靶细胞。

53、然后对靶细胞进行染色，存留的活细胞可，而死细胞则不能。经洗涤后，去除死细胞及剩余染色液后，再将吸附于培养板上的细胞用去垢剂溶解，以一定的波长测定该溶液的光密度值，并与不含肿瘤坏死因子的细胞对照比较，则可计算得到检测样本对细胞的率。一般以 50%细胞毒作用的效价作为肿瘤坏死因子的抗肿瘤活性。二、器材与试剂1.器材：倒置显微镜、酶标仪、微量移液器、移液头细胞培养板、试管擦镜纸2.试剂：（1）肿瘤坏死因子（TNF）标准品培养箱RPMI-1640 细胞培养液（市售）放线菌素 D 溶液L929 细胞株悬液细胞染色液去垢剂溶液三、操作步骤1.2.将待检样品及 TNF 标准品依次对倍稀释成四个不同滴度（原液

54、、1:2、1:4、1:8）。按下列排列方式每孔分别加入 100l 的待检样品或标准品，每份样品都须作复孔。3.4.将一定浓度的放线菌素 D 溶液（4g/ml）加入各细胞，每孔 50l。5L929 细胞株悬液稀释成一定浓度（810 /ml），接种入细胞培养板的将，每孔 50l。加完后置 37培养箱内培养 24 小时。5.另取一块已培养 24 小时的细胞培养板，弃去培养液，用生理盐水洗涤一次，然后加入细胞染色液 200l，染色 3 分钟。弃去细胞染色液，以流水轻轻冲洗三次，再加入去垢剂溶液 100l，置 37二6.氧化碳培养箱孵育 30 分钟，调零亦需同时各加入 100l 去垢剂。7.取出细胞培养

55、板，用酶标仪测定各孔的 OD 值。四、操作注意事项1 加细胞悬液时应不断加以混匀，加完后用倒置显微镜检查一下各均匀。细胞是否待将标本12TNF 标准品（U/ml）34细胞对照56A B C D原液原液1:21:21:41:41:81:81616884422培养液培养液调零调零2 加样时，注意不能移液头，以免交叉污染。3 加去垢剂后，应用倒置显微镜观察一下细胞是否完全溶解，待完全溶解后方可比色。五、实验结果与分析1OD 值：按加样顺序，即下表各孔OD 值。2 判别标本内TNF 含量计算待检标本及细胞对照复孔的平均OD 值，再按下列公式计算各孔的细胞杀伤率。细胞对照孔OD 值标本孔 OD 值细胞率

56、（%）=100%，再乘上该稀细胞对照孔OD 值率的稀释度算作 1 个 TNF 活性然后，选取最接近 50%释度，即是该标本所含 TNF 的活性值。待将标本12TNF 标准品34细胞对照56A B C DODODODODODODODODODODODODODODODODODOD调零调零附录：免疫学技术实验常用试剂配方实验一1.饱和硫酸铵溶液取 800 克硫酸铵，加蒸馏水 1000 毫升，加热至 5080，使其溶解，置室温过夜后，用脱脂棉过滤，然后以 NH4OH 调整至7.8 备用。2.层析洗脱液（8.0，0.005M 磷酸缓冲液）液： 8.0，0.2M 磷酸缓冲液0.2M Na2HPO412H2O

57、0.2M NaH2PO42H2O71.64g 加D.W 至 1000ml31.21g 加D.W 至 1000ml取 0.2M Na2HPO4 溶液 947ml 和 0.2M NaH2PO4 溶液 53ml 混合，即为酸缓冲液。工作液： 8.0，0.005M 磷酸缓冲液8.0，0.2M磷取液用D.W 40 倍稀释即为工作液。3.生理盐水（0.14M NaCl）NaCl8.5g加D.W 至 1000ml实验二1.Hs 液（生理平衡盐溶液）液：A 液NaCl KClMgSO47H2OMgCl26H2O CaCl280g 4g 1g1g 加 D.W 至 400ml1.4g 加 D.W 50ml 加热溶解混合后加D.W 至 500ml，4保存备用。B 液Na2HPO412H2O KH2PO42H2O葡萄糖0.4%酚红1.52g0.6g10g50ml 加 D.W 至 500ml再加 1ml 氯仿，4保存备用。工作液：取 10ml A 液与 10ml B 液，加 D.W 至 200ml 即可。2.无钙、镁H液：A 液s 液NaCl KCl81.8g4g加 D.W