铁皮石斛的组织培养

1、由于石斛自然繁殖力极弱，生长缓慢，加之人们掠夺性采挖，资源已严重枯竭。而石斛栽培 一直未解决其存活率低、进入盛产期年限长等问题，故石斛药源一直处于紧张状态。因此， 组织培养、遗传转化、菌根技术、悬浮培养等生物技术在石斛的应用意义重大，甚为迫切。 石斛的组织培养，可用种子、根、茎尖、茎节及叶等为外植体，但以种子进行组培快繁的为 多。原球茎的增殖分化是石斛试管苗繁殖的关键，因此，研究原球茎增殖分化的适宜培养条 件非常重要。特别是应用组织培养技术快速大量繁殖石斛试管苗，是解决其种苗与发展生产 的有效途径。铁皮石斛的组织培养铁皮石斛，又名铁皮兰、节草、耳环石斛等。野生铁皮石斛为国家珍稀濒危保护植物（三

2、级）。 由于其生长环境要求特殊，野生资源已濒临灭绝。现云南晨安生物科技开发有限公司对铁皮 石斛的组培快繁已获成功，月出苗量50万瓶以上，为铁皮石斛工厂化育苗和大面积栽培闯 出了一条新路。1胚培养（种子培养）：取人工授粉的铁皮石斛果实，用75%的乙醇表面消毒，30s后再 用0.1%升汞溶液消毒8min，无菌水冲洗45次。在无菌操作下，把果实切成0.1mm见 方的小块，接种到培养基上，每瓶35块。研究结果表明，N6培养基对种子萌发和生长 最好，蔗糖浓度2%最佳，NAA浓度0.20.5mg/L最适合胚的萌发和生长；种子培养中加 入椰乳对胚萌发和萌发后的初期生长起促进作用而香蕉汁对继代培养中石斛的生根

3、和壮苗 起促进作用，生根和壮苗培养中不加入NAA ,只用N6+10%香蕉汁，苗长得更粗壮。培养 温度25-28，光照强度16002000lx，每日1012h。种子萌发后，转管34次，当 幼苗长出45片真叶并具有34条12cm长的根时，可将试管苗进行炼苗后移栽。在实验中尚发现，石斛原球茎的增殖与胚龄相关，不同胚龄培养，其萌发率不同：胚龄45 天以下，萌发率极低，萌发时间长；60天胚龄的胚具34个细胞，萌发率为6%; 90天胚龄的胚细胞为74个，萌发率为87%; 120天胚龄的细胞数为90个，萌发率95%以上。实验表明，组织培养的最适胚龄以种子成熟时较好，随着胚龄增长，其胚细胞愈多，萌发率 越高。

4、原球茎增殖分化的最适培养基为改良N6+NAA0.2mg/L+2%蔗糖。种子萌发成苗后 需及时将小苗转移到合适的培养基中进行生根、壮苗培养。有报道，铁皮石斛试管茁壮苗阶 段的适宜培养基为B6 （或1/2MS ） +10%香蕉水提物+NAA2.0mg/L+2%蔗糖。生根壮苗 培养基为改良N6+10%香蕉+2%蔗糖，苗长得更粗壮。将萌芽石斛继代培养于N6+10% 香蕉汁生根壮苗培养基中，苗长得更粗壮。2茎尖培养：取铁皮石斛当年萌发的嫩茎尖，用10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗 45次后接种到培养基上。研究结果表明，培养温度为2528C，光照度16002000lx , 每日光照1012h。在MS

5、+NAA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L培养基中培养30天左右，外植 体则可诱导出大小不一的白色颗粒状愈伤组织，再过20天形成不定芽。将愈伤组织和不定 芽切割开，再接种到MS+NAA0.2mg/ L+6-BA0.5mg/L中，愈伤组织会增殖并产生不定 芽，再将不定芽移到N6+10%香蕉汁中培养30天左右，则会生根长成植株。3幼嫩茎段培养：剪取铁皮石斛幼嫩茎段，按常规表面灭菌，切成2.0cm左右的切段，每 一切段应至少保留1个节，将其接入芽增殖培养基MS+NAA0.10.5mg/L+6-BA0.52.0mg/L（蔗糖浓度 3.0%, PH5.45.8,下各培养 基均同）中培养。培养条件：培

6、养温度（252 ）C,连续光照培养，光照强度1500lx。培 养3050天后，可在节间处长出12个新芽。将新芽切下，再接入芽增殖培养基中继代培 养，经过30天培养，在切口处长出46个芽，形成丛生芽簇。将丛生芽切割后，在芽增 殖培养基中继续增殖培养，则可获得大量丛生芽。将上述丛生芽切割成单苗，转入壮苗培养 基MS（无激素）中培养,40天后，芽可发育成高3.0cm以上并具23片叶的健壮无根苗。再将经过壮苗培养的无根苗，转接到生根培养基1/2MS+IBA0.1mg/L中培养406 0天， 在苗基部便可长出多条肉质、绿色气生根，形成完整植株。尚有报道，取铁皮石斛茎，去叶、洗净、表面灭菌后，在无菌条件下切成约5mm长的小段， 每段必具一个茎节，接种于1/2MS或努森培养基内，置（261 ）C光照条件下培养，约2 周，腋芽长出，约1个月则可形成完整植株。4炼苗与移栽：当试管苗有45片叶展开，并具有34条12cm长的根时，即可揭开瓶 盖，在室内炼苗1周后，将再生植株移植于细土与牛粪（1：2 ）的栽培基质中，盖上薄膜， 保持湿度90%以上，基质以湿润、不积水为宜，置通风阴凉处，成活率可达60%。或以碎 砖4份，碎木炭1份，珍珠岩和蕨根适量组合为移栽基质，其既能透气，又能排