细胞生物学试验篇

1、.：.； PAGE 16实验篇实验一 细胞的形状察看及其大小丈量【实验目的】1、经过对原核和真核各种形状细胞的光学显微镜察看，了解细胞的形状及其显微构造；2、学习显微丈量的方法，对细胞的大小有不断观认识。【实验用品】普通光学显微镜;目镜测微尺;镜台测微尺;载玻片;盖玻片等。【实验资料】小白鼠肝细胞切片;鸡血红细胞;蚕豆叶片横切片;洋葱。【实验内容和方法】(一)细胞形状察看l、动物细胞的察看1人肝细胞切片：在显微镜下仔细察看肝细胞的形状构造。留意肝细胞之间的界限、细胞的外形、细胞核的外形和数量、核仁的外形和数量、细胞质的形状构造以及细胞质和细胞核染色的区别。2鸡血细胞涂片的察看：留意察看血细胞的

2、组成；红细胞、白细胞、血小板的形状特点。2、植物细胞的察看1取蚕豆叶片横切片的察看：留意表皮细胞和叶肉细胞的根本构造。2洋葱表皮细胞的形状察看：用镊子撕取洋葱表皮，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片。在显微镜下察看的形状和构造。二细胞的大小和丈量1、测微尺的运用目镜测微尺是一块圆形玻片，中心刻有一尺，长510mm，分成50100格。每格的实践长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺，长1mm或2mm，分成100格或200格，每格的实践长度0.01mm(10m)。当用目镜测微尺来丈量细胞的大小时，必需先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格的长度。方法如下

3、：(1)卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。(2)将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。(3)小心挪动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进展调焦)，使两尺左边的不断线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线(如下图)。(4)记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等于多少m： 0123测定目镜测微尺每格实长的图解上尺：目镜测微尺；下尺：镜台测微尺镜台测微尺的格数 目镜测微尺每格的微米数= 10 目镜测微尺的格数例如，图中镜台测微尺1格=

4、目镜测微尺6格，代入公式得：目镜测微尺每格=1610m=1.66m (5)取下镜台测微尺，换上需求丈量的玻片标本，用目镜测微尺丈量标本。2、计算：根据丈量结果计算各种细胞及细胞核的体积。椭球形：V=4ab23 a-长半径 b-短半径圆球形：V=43r3 r-半径圆柱形：V=r2h r-半径 h-高【作业与思索】1、血细胞分为哪几大类？分别描画他看到的不同血细胞的形状，并论述其功能。绘图。2、恣意选择他所看到的动物细胞和植物细胞各一个，绘图并进展适当标注，丈量其大小，并比较动植物细胞大小的差别。3、在不同的放大倍数下，所测得的细胞大小一致吗？他以为在哪个放大倍数下测定得比较准确？为什么？实验二

5、PASPeriodic Acid Schiff反响显示糖原和其它多糖物质【实验目的】1、熟习PAS法原理及操作步骤；2、察看PAS反响的染色结果，并察看多糖在组织细胞中的分布。【实验原理】多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。广泛分布于动、植物界。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，普通称为构造多糖。另一些多糖在生物体内作为能量储存，如淀粉植物和糖元动物，在需求时可以经过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。还有许多多糖具有更复杂多样的生理功能，如粘多糖、血型物质等，它们在生物体内起着重要的作用。淀粉和糖原均由D葡萄糖的分支

6、或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离的醛基(-GHO)，游离醛基与Schiff试剂反响生成紫红色产物。【实验用品】(一)试剂：1、过碘酸酒精溶液：取过碘酸HIO42H2O0.4g溶于35 m1纯酒精中 ，参与5 m1 的0.2M醋酸钠醋酸钠2.72g溶于100 m1蒸馏水中，再参与15ml蒸馏水。溶液配好后保管在04的冰箱内，并加黑纸保管，此液如显黄色即失效。2.Schiff试剂：将0.5 g碱性品红参与100m1煮沸的蒸馏水中，时时摇荡玻璃瓶或者搅拌，煮5min，使之充分溶解；然后冷却至50时过滤到具有玻塞的棕色试剂瓶，参与10ml的l

7、molL的HCl，冷却至25时参与0.5g偏重亚硫酸钠，在室温黑暗条件下静置24h，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g猛烈振荡摇匀1min；过滤，滤液为无色。置棕色瓶密封，外包黑纸，4保管。本试剂可提早一天预备，此液必需坚持清澈透明、无色也无沉淀，容器要小，装满后仅留很小的空隙，其中不应有任何氧化剂，不要过长时间暴露在空气中。如有白色沉淀就不能再用，如颜色变红可以参与少许偏重亚硫酸钠，使其再转变为无色就可以再用。3、亚硫酸水溶液：取10偏重亚硫酸钠Na2S2O5或K2S2O520ml、1mmolL-1 HCl 20ml和400ml纯水混匀即可。此液运用前配制，否那么会因SO2逸出失效。此液

8、中所用的偏重亚硫酸钠或钾要与Schiff试剂中所用的一样：4、苏木精溶液常用的有5种，其中德拉菲氏苏木精染液(Delafield 苏木精染液)配法如下:甲液苏木精5g、无水乙醇30ml乙液铵矾，即硫酸铝铵饱和水溶液：比例为1g硫酸铝：11ml水，用时配110ml,取100ml丙液甘油125ml、甲醇125ml。配法如下：1.将甲液一滴一滴地参与乙液中，并随时用玻璃棒搅动；2.然后暴露于阳光和空气中约1周到10天；3.参与丙液；4.将混合液静置2个月至颜色变深为止可过滤，此液成熟后须置于阴冷处塞紧瓶口，可长期保管运用，运用时可将染剂1份用35份蒸馏水稀释，那么染色后分化更明显。、梯度乙醇溶液：1

9、00，95，90，80，70，50各两份。一份用于脱腊复水，一份用于脱水。二甲苯7、100%乙醇+二甲苯1：1二)器具：载玻片 、盖玻片、染色缸、显微镜 、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片 三资料：土豆；小鼠肝细胞石蜡切片【实验步骤】一土豆切片的察看制造土豆徒手切片 过碘酸处置1530min 70%乙醇 1min schiff试剂 15 min 亚硫酸水漂洗23次 蒸馏水漂洗 镜检二小鼠肝细胞切片的察看取鼠肝石蜡切片 二甲苯脱蜡约10min 二甲苯+100%乙醇3 min梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇100，95，90，80，70，50中约23 min 过碘酸 氧化1530 min 蒸馏水漂洗 S

10、chiff试剂1530 min 亚硫酸水漂洗23次 蒸馏水漂洗 苏木精染色10 min 流水冲洗梯度乙醇脱水50，70，80，90，95，100，在各乙醇浓度中约23 min 100%乙醇+二甲苯23 min二甲苯适度透明 指甲油封片 镜检【作业与思索】1、 为所察看到的土豆切片和鼠肝切片绘图，标注其多糖的位置，并描画这两种细胞的多糖分布特点。2、影响PAS反响染色效果的关键步骤是什么？3、如何制造徒手切片？应留意什么才干得到薄而均匀的切片？锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。【本卷须知】1.过碘酸氧化作用时间稍长，会使反响更加充分。2.Schiff试剂作用时间略长，会使染色效果明显，但过

11、长将导致染色太深，也不利于察看。3.二甲苯溶解性很强，时间要把握好，前者以脱蜡为准，不要有空气，后者以透明为准。假设片子变黑，重新放回二甲苯，再透明一次。4.试剂反复运用后，实验结果不明显脱蜡不完全、染色不好等，因此在实验中要检查各试剂能否干净，假设污染严重，一定要改换。实验三 叶绿体的分别与荧光察看【实验目的】1、经过植物细胞叶绿体的分别, 了解细胞器分别的普通原理和方法. 2、察看叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟习荧光显微镜的运用方法. 【实验原理】 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进展差速离心，是分别细胞器的常用方法。叶绿体的分别应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖

12、溶液)中进展, 以免浸透压的改动使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完好细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分别过程最好在05的条件下进展，假设在室温下，要迅速分别和察看。 某些物质在一定短波长的光如紫外光的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出对比射光波长更长的光如可见光，这种光就称为荧光。假设停顿供能，荧光景象立刻停顿。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光称为自发荧光，如叶绿素的火红色荧光。有的生物资料本身不发荧光，但它吸收荧光

13、染料后同样也能发出荧光称为间接荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进展察看。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进展检测时,将遭到许多要素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光察看时应抓紧时间, 有必要时立刻拍照。另外,在制造荧光显微标本时最好运用无荧光载片、盖片和无荧光油。 【实验用品】 1.器材： 1主要设备: 普通离心机,粗天平,荧光显微镜；2小型器材: 剪刀，研钵，移液管，漏斗， 滴管, 10ml刻度离心管,纱布假设干, 无荧光载玻片和盖玻片。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不

14、舍，金石可镂。2.资料： 新颖菠菜。 3.试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridine orange). 0.01%吖啶橙的配制：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4冰箱保管。放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液pH4.89ml稀释。吖啶橙Acridine Orange，AO是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光即着色特异性，这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置

15、多，故发红色荧光。【实验方法】 1、叶绿体的分别1选取新颖的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;2加10ml的0.35molL-1 NaCl溶液研磨匀浆;3用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;4取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;5将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体混有部分细胞核；6沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。2、叶绿体的察看 1滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下察看，留意察看所分别的叶绿体的形状以及其能否完好。2滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无荧光盖片；在荧光显微镜下察看叶绿体有

16、无自发荧光，其颜色如何。3滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下察看其次生荧光。3. 完好细胞中的叶绿体察看1用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。2用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。3将以上两种制片进展一下三种方式的察看：a在普通光镜下察看。b在荧光显微镜下察看。c再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后，在荧光显微镜下察看。【本卷须知】要得到完好的、有活性的叶绿体，须低温下迅速提取，涂片后立刻察看。【作业与

17、思索】 1. 描画他所察看到的实验景象，自发荧光和次生荧光的区别？2叶绿体分别的原理是什么？操作过程中应留意什么？实验四 吖啶橙(acridine orange)染色 察看口腔上皮荧光【目的要求】1、熟习荧光显微镜的原理及运用方法。2、察看荧光染料染色后结合物发出的荧光。【实验原理】吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。【实验用品】1器材：荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；2资料：口腔黏膜上皮细胞暂时制片；3试剂:1)0.1mol/L pH7.0 PBS液。A液：

18、NaH2PO4H20 2.76g加蒸馏水至100ml；B液，Na2HPO47H20 5.36g加蒸馏水至100ml；取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100ml。2)0.1吖啶橙原液：0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。临用时配制0.01吖啶橙染液：将0.1吖啶橙原液用PH7.0 PBS液稀释。395乙醇【方法与步骤】1用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上；295乙醇溶液固定5min；3滴加0.01吖啶橙染液染色5min；4用PBS缓冲液缓慢冲洗；5加盖玻片镜检。【察看结果】描画他所察看到的实验景象，并绘图，阐明荧光的颜色。实验五 植物细胞骨架的光学显微镜

19、察看【实验目的】掌握植物细胞骨架的制备方法，并用光镜察看洋葱内皮细胞的骨架网络构造。 【实验原理】细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络构造，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装构造的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形状构造及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本实验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处置植物资料时，可将细胞的膜构造和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保管下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状构造。 【实验用品】1.器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴

20、管、擦镜纸、50ml烧杯； 2.实验资料：洋葱鳞茎；3.试剂：1 pH6.8的磷酸缓冲液；索伦森Sorensen磷酸缓冲液溶液A：Na2HPO42H2O 11.876g加蒸馏水至1L溶液B：KH2PO4 9.08g加蒸馏水至1L对照下表取一定体积的溶液A，再参与足够的溶液B至总体积达100ml，即得到所需pH的缓冲液。溶液ApH溶液ApH溶液ApH0.64.949.26.881.87.42.35.361.27.085.27.54.95.667.07.188.57.612.16.072.67.293.67.826.46.477.77.396.98.02M-缓冲液 ：50mmol/L (pH6.7

21、)咪唑、 50mmol/L KCl、0.5mmol/LMgC12 、 1mmol/L EGTA、0.1mmol/L EDTA、1mmol/L巯基乙醇、 4mmol/L甘油、1mol/LHCl调pH至7.2。 31%TritonX-100：用M-缓冲液配制。43%戊二醛：用pH6.8的磷酸缓冲液配制。50.2%考马斯亮蓝R250染液：0.8g考马斯亮蓝R250、46.5ml甲醇、7ml冰醋酸、46.5ml蒸馏水。650，70，95乙醇7叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶【实验步骤】取材：撕取洋葱鳞茎内表皮0.51cm2，浸入装有磷酸缓冲液PH6.8的小烧杯中，处置510分钟。去垢处置：弃去PBS缓

22、冲液，用吸水纸吸净剩余的PBS，加适量1%Triton X-100，使液体充分浸泡资料，并立刻放入37恒温箱或水浴锅中处置30分钟。冲洗：吸去1%Triton X-100，立刻参与M缓冲液悄然冲洗3次，每次35分钟。固定：用吸管将M缓冲液吸尽，参与3%戊二醛，固定1020分钟。冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸缓冲液PH6.8冲洗3次，每次35分钟。染色：吸去PBS缓冲液，参与适量0.2%考马斯亮蓝R250染料，染色1020分钟。制片：吸去染料，用水冲洗留意不要将资料丧失。将洋葱表皮伸展铺平于载玻片上，加盖盖玻片。镜检：将制好的片子置于低倍镜下，可见到规那么陈列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞质

23、内可见到被染成蓝色的粗细不等的分枝状构造，这便是细胞骨架。转高倍镜继续察看，调理细螺旋可见到细胞骨架的立体构造。在有样品的50ml烧杯中，顺序经过如下药物：50、70、95乙醇，95乙醇叔丁醇1：1，叔丁醇每级510min；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯每级510分钟，然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好的可加一滴中性树胶，盖上盖玻片。【作业与思索】1. 绘出洋葱细胞的骨架网络分布。2根据M-缓冲液的成分，分析其作用。3经过实验过程，推测他所察看到的细胞骨架属于胞质骨架中的哪种类型，为什么？实验六 PEG法诱导细胞交融【实验目的】1. 了解细胞交融的原理和过程；2. 初步掌握利用PE

24、G介导动物细胞交融的实验技术。【实验原理】细胞交融，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。由于不仅同种细胞可以交融，种间远缘细胞也能交融，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞交融技术目前较广泛运用于细胞生物学、遗传学和医学研讨等各个领域，并且获得显著的成果。化学交融方法普通运用聚乙二醇(PEG)诱导细胞在体外进展交融。商品PEG的相对分子质量有200-6000范围内的各种规格，它们均可用作细胞交融剂。普遍以为PEG分子能改动各类细胞的膜构造，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发陌生散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相

25、互亲和以及彼此的外表张力作用，从而使细胞发生交融。促进细胞交融的效能，必需采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞能够因脱水而遭到显著的破坏。因此，选择适宜的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG交融技术的关键。该方法的优点是：操作简单，容易获得交融体，交融效果好。细胞交融率是指在显微镜的一个视野内，已发生交融的细胞核总数与该视野内一切细胞(包括已交融的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。【实验用品】1器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。2资料：鸡血悬液；3试剂：10.85%的生理盐水；2GKN液：8.0g的NaCl，0.4g50%m/V

26、PEG37温浴：取50gPEG相对分子质量4000放入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG冷却至5060，勿让其凝固。参与50ml预热至50的GKN液，混匀，置37备用。31%詹那斯绿B；4) Hanks溶液含NaCl，KCl, Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, 葡萄糖，酚红Hanks原液10NaCl 80.0gNa2HPO412H2O 1.2gKCl 4.0gKH2PO4 0.6gMgSO47H2O 2.0g葡萄糖 10.0gCaCl2 1.4g称取1.4g的CaCl2，溶于3050ml的重蒸水中。取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按照

27、上述配方水需，逐一称取药品。必需在前一药品完全溶解后，方可放入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将曾经溶解的CaCl2溶液参与，最后加水定容至1000ml。Hanks液：Hanks原液 100ml重蒸水 896ml0.5酚红 4ml配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4保管。【实验步骤】Hanks溶液换成GKN溶液1.鸡血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:31:4的比例稀释，制成鸡血红细胞细胞悬液，放入4冰箱内可保管3-4天；2.取鸡血1ml，参与4ml0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，反复上述操作一次；3.沉淀用适量Hanks溶液重悬浮，100

28、0rpm离心3min, 弃上清液，用Hanks溶液稀释沉淀，制成10%左右的细胞悬液，迅速在显微镜下察看细胞密度；4. 取1ml上述细胞悬液，加0.5ml 50% PEG溶液，37水浴中进展细胞交融30min左右；5.缓慢参与Hanks溶液，悄然混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来镜检，室温静置约20min;6.取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右；7.镜检，察看细胞交融景象。【实验结果】1.绘出已交融的细胞形状图，描画他所察看到的细胞交融景象。2.计算细胞交融率。【作业与思索】1请分析Hanks溶液的作用是什么可以从其成分的角度来回答？2. PEG诱导

29、细胞交融率受哪些要素影响？3他以为在进展细胞交融时，要留意哪些问题?实验七 动物骨髓细胞染色体标本的制备与察看【实验目的】1掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术2察看染色体的数目以及形状特征【实验原理】骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂才干，因此不用经体外培育，也不需求植物血球凝集素PHA的刺激，可以直接察看到分裂细胞。经过秋水仙素处置后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制造出理想的染色体标本，是研讨动物细胞遗传学的好资料。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在普通的实验室都可进展。【实验仪器、资料和试剂】1.仪器

30、：天平、低速离心机、恒温水浴锅、显微镜、1ml注射器、解剖盘、解剖剪、刀片。试管架、10ml离心管、吸管烧杯、量筒。酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸2. 资料小白鼠或无尾两栖类青蛙或蟾蜍3. 试剂1Carnoy固定液新配制的甲醇：冰醋酸3:120.1秋水仙素：称取10mg秋水仙素，参与10ml的0.65生理盐水1ml含有1000ug，0.1ml含有100ug秋水仙素；30.85%生理盐水；柠檬酸钠溶液；0.4%KCl溶液0.075M 40.0667mol/L磷酸缓冲液pH7.4A液：1000ml含Na2HPO4 9.465 g或 Na2HPO42H2O 11.876g 或Na2HPO

31、412H2O23.88gB液：1000ml含KH2PO4 9.07g取A液80ml+B液20ml混匀成pH7.451:10 Giemsa磷酸盐缓冲液Giemsa母液：Giemsa粉0.5g，甘油AR级33ml，甲醇AR级33ml先将少量甘油参与研钵中，将Giemsa粉充分研细，再倒入剩余甘油，并在56温箱中保温2h，然后再参与甲醇混匀，储存在棕色瓶中。【方法与步骤】1.骨髓细胞制备如下表步骤小鼠两栖动物1秋水仙素注射按4ug/g体重注射34h后处死按30ug/g注射78h后处死2取后肢胫骨和股骨，切去两端。3取骨髓细胞2%柠檬酸钠溶液1ml1%柠檬酸钠溶液1ml用1ml注射器汲取柠檬酸钠溶液，

32、经过针头将溶液注入骨髓腔，冲出骨髓细胞置10ml离心管中细胞冲净后骨髓腔由粉红变为白色；摘掉针头，用注射器筒悄然反复吸打，使分散成单个细胞。4低渗处置预热及低渗水浴温度：37低渗时间：30min预热及低渗水浴温度：26低渗时间：30min视细胞多少参与79ml 预热的0.4%KCl溶液，在水浴中低渗处置。2. 1000rpm离心8min。3. 弃上清，沿离心管壁缓慢参与新配制的甲醇：冰醋酸3:1固定液5ml，留意不要激动细胞团块。加完后立刻用吸管将细胞悄然吸打均匀，静置固定20min。如此反复固定23次，每次20min。4 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡参与少量新配制的固

33、定液，细胞团块悄然吸打成悬液留意：吹打不要过于用力。5. 在干净并预冷的载玻片上滴23滴细胞悬液，枯燥。留意：滴片时滴管离载玻片有一定高度有助于染色体分散6. 将玻片细胞面朝上程度放置，滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液34ml，染色10min。7. 冲洗掉染液，枯燥后镜检。【结果分析】1样品的染色体数目是多少？19对常染色体，1对性染色体。共40条2要胜利制备染色体标本，在操作中应留意哪些问题？【实验提示】过去实验中曾经出现的问题1染色后发现没有骨髓细胞缘由：未能将细胞从骨髓腔中洗出；离心不慎呵斥细胞流失；低渗过度呵斥细胞破裂，染色体流失；冲洗不慎等2染色体分散不佳而呵斥无法计数缘由：低

34、渗控制不好呵斥细胞体积过小；枯燥过度等留意：随时镜检才干确定各步骤能否存在问题低渗与离心等步骤的操作要轻。 察看细胞的规范为：1细胞完好，轮廓明晰，染色体分布在同一程度面上。2染色体形状和分布良好。3最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免过失。4所察看的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。在所察看的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。 【作业和思索】选择染色体明晰，分散度好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影，打印出照片。在制备小鼠骨髓细胞染色体时为什么要进展预固定？由于在之前他得到的染色体都处于不同的分裂期，预固定是为了使这些细胞及其

35、染色体都固定在当前所处的时期，便于察看。其本质就是把细胞杀死，使其无法继续进展有丝分裂。天才是由于对事业的热爱而开展起来的。几乎可以说，天才就其本质而论只不过是对事业，对任务的热爱而已。综合大实验：烟草愈伤组织细胞的培育及细胞凋亡的诱导和察看【实验目的】1. 将烟草的悬浮细胞诱导发生细胞凋亡。2. 了解和掌握凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状条带。掌握凋亡细胞的形状学察看方法。【实验原理】细胞凋亡被分为两类：受体介导的细胞凋亡和线粒体介导的细胞凋亡。本实验主要涉及线粒体介导的细胞凋亡。凋亡的细胞可用多种方法来检测。凋亡出现时，细胞内源性的核酸内切酶被激活，将染色质DNA自核小体间降解，构成

36、相差180-200bp的大小不等寡核苷酸片段。提取凋亡细胞的DNA，经琼脂糖电泳，分别不同长度的DNA片段，再经溴化乙锭染色，在凝胶成像仪下察看，可见特征性的梯状条带。这就是凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测。【实验步骤】一细胞凋亡的诱导1. 48热激烟草悬浮细胞2、4、8小时后，恢复25培育12小时，用于细胞凋亡的检测。2. 4处置烟草悬浮细胞2、4、8个小时后，恢复25培育12小时，用于细胞凋亡的检测。3. 200、400、800ppm的乙烯利处置烟草悬浮细胞12小时后，用于细胞凋亡的检测。二凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测实验用品1. 资料：已被诱导凋亡的烟草悬浮细胞2. 试剂：琼脂糖，2CTAB缓冲液2% CTAB、100mmol/L Tris-HCL(pH8.0)、20mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4mol/L NaCL、1% PVP，氯仿，异戊醇，乙醇，异丙醇，液氮3. 仪器：高速冷冻离心机，恒温水浴，电泳安装实验步骤在1.5ml Eppendorf管中，参与500l的2CTAB缓冲液