DNA的复制和修复

1、 第三十四章 DNA 的复制和修复遗传信息传递的 中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心

2、法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。 第一节 DNA的复制一、DNA的半保留复制DNA的半保留复制的概念 DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。 在1958年由M. Mese

3、lson 和 F. Stahl 所完成的实验证明。将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果： 实验证明 :MeseLson和Stahl 的CsCL密度梯度离心实验大肠杆菌长期在15N标记的15NH4CL培养液中生长15代15N（DNA）转移到14N标记的普通14NH4CL培养液中生长1代14N- 15N（DNA）转移到14N标记的普通14NH4CL培养液中生长2代14N- 15N（DNA）14N（DNA）转移到14N标记的普通14NH4CL培养液中生

4、长n代14N（DNA）DNA的半保留复制实验依据 DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。 二、DNA的复制起点和方式1、环状双链DNA分子固定起点单向或双向复制2、线状双链DNA分子多个起点双向复制滚环复制X174，M13，G4等单链环状DNA噬菌体 第二阶段复制都是滚环复制。3、特殊的复制方式D环复制线粒体DNA为D环复制。三、DNA聚合反应有关的酶 1956年 Kornberg发现的DNA聚合酶I（100kg大肠杆菌可以分离0.5g纯化的酶）由一条肽链组成，有53聚合酶活力， 53

5、外切酶活力，和3 5外切酶活力。用蛋白酶水解得到的Klenow片段有3 5外切酶活力和5 3聚合酶活力。图示为 Klenow片段与DNA的结合，模板链(12nt)为蓝色，引物链(14nt)为红色。DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA的相互作用1、DNA聚合反应和聚合酶DNA + ndNTPDNA-ndNMP+(ppi)nDNA聚合酶特点以四种dNTP作为底物反应需要接受模板的指导反应需要有引物DNA链的生长方向为53产物DNA性质与模板相同DNA聚合酶催化的链延长反应35模板链5RNA引物子链335533553 功 能DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶53聚合酶作用53外切酶作用35外切

6、酶作用2、大肠杆菌DNA聚合酶+-+DNA聚合酶是负责DNA合成的主要酶DNA聚合酶的作用是除去引物并填满缺口-DNA聚合酶的3- 5 外切酶水解位点3355错配碱基3- 5核酸外切酶水解位点pol 为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenow fragment，具有53聚合酶活性和35外切酶的活性。 DNA聚合酶全酶核心酶Pol IIIPol III延长因子DNA聚合酶二聚体pol 由十种亚基组成，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。 3、DNA连接酶DNA连接酶(

7、DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。DNA连接酶催化的条件： 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NADPPi或NMNATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链五、DNA复制的拓扑性质 原核生物的拓扑异构酶可以消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。 原核生物的拓扑异

8、构酶可以在消耗ATP的条件下连续的引入负超螺旋，在无ATP消耗的条件下，可以松弛负超螺旋。 真核生物的拓扑异构酶可以消除负超螺旋，也可以消除正超螺旋。 真核生物的拓扑异构酶（分为和两种）可以消除负超螺旋和正超螺旋，但不能引入负超螺旋。 拓扑异构酶主要和转录有关。 拓扑异构酶主要与复制有关。 拓扑异构酶引入负超螺旋可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 六、DNA生物合成过程 （一）、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 1、预引发：（1）解旋解链，形成复制叉： 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB

9、）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。 解螺旋酶解螺旋酶（unwinding enzyme） ，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。 单链DNA结合蛋白单链结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为： 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在,，便于以其为模板复制子代DNA； 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。 （2）引发体组装

10、：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。 *引 发 体引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i、蛋白n、蛋白n”、蛋白dnaC与引物预合成有关，蛋白n与蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。 大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCT

11、NTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型2、引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。 RNA引物参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。 复制的起始（二）、复制的延

12、长 1、聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长随从链)和（延长领头链）。 2、引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。 *冈崎片段和DNA的半不连续复制 由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向

13、为53，这一条链被称为领头链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。 3553复制叉移动方向5353前导链后随链冈崎片段DNA的半不连续复制复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚

14、合酶III全酶引物引物体引物体解旋酶解旋酶（三）、复制的终止 1、去除引物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。 2、连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。 复制的终止七、真核细胞DNA的复制1、DNA聚合酶在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合

15、酶（pol ），DNA聚合酶（pol ）。 DNA聚合酶主要是用来起始链的合成，而DNA聚合酶则是用来延伸新生成的链的。另外两种DNA聚合酶和，则主要是用来参与修复反应的。而DNA聚合酶则是负责线粒体DNA的复制的。DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶分子量11000-220000 45000 60000亚基数 多个 一个 一个细胞内分布 细胞核 细胞核细胞核和线粒体酶活力占总量的百分比 80% 10-15% 2-15%3-5外切酶活力 无 无 有引发酶活性 有 无 无功能染色体DNA的复制DNA的重组和修复线粒体DNA 的复制真核细胞DNA聚合酶 端粒（telomere）是指真核生物染色体线

16、性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。 2、端粒和端粒酶 DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。 初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖

17、细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。端粒酶(telomerase)的作用机制Movie 1Movie 2E.coli SV40/人 酵母 功能DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶DnaC P ? Cdc6 装配因子DnaG DnaG Pol-引发酶 Pol-引发酶 引发酶 Pol的 亚基 Pol Pol,Pol 聚合酶 Pol的亚基 Pol Pol,Pol 校正 Pol的亚基 PCNA(增殖核抗原) PCNA 滑动钳 复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器 SSB RF-A RF-A 单链结合蛋白3、原核和真

18、核生物复制体系的比较八、复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109-1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则）b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）c、起始时以RNA作为引物DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正 确核苷酸555333切除错配核苷酸第二节 DNA的损伤与修复 一、DNA的损伤（突变）由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链

19、的断裂，重组等。 （一）引起突变的因素：1自发因素： (1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。 (2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。 (3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。 2物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。 3化学因素： (1)脱氨剂：如亚

20、硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。 (2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。 (3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。 (4)碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。 (5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。 （二）DNA突变的类型： 碱基的转换（三）DNA突变的效应： 1同义突变：基因突变导致mRNA暗码子第三位碱基的改变但不引起暗码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译

21、效率降低。 2误义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。 3无义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换而改变成终止暗码子，引起多肽链合成的终止。 4移码突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。 二、 DNA的损伤修复1、错配修复 大肠杆菌的Dam甲基化酶可以使DNA的GATC序列中A的N6甲基化，新合成的链在短期内未能甲基化。 如果有错配碱基对，则需切除新合成链的错配区，MutS二聚体识别并结合到错配碱基部位，mutL二聚体与MutS结合，使DNA形成突环，复合体随ATP水解而移动，直

22、至遇到GATC序列，随后核酸内切酶MutH结合到MutSL上，将未甲基化链GATC位点G的5端切开。切开处位于错配碱基的3侧切开处位于错配碱基的5侧2、直接修复：紫外线照射使DNA分子中同一条链两相邻胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。这是一种高度专一的直接修复方式。从单细胞生物到鸟类都存在光复活酶，但高等哺乳动物却没有光复活酶，其胸腺嘧啶二聚体需要通过切除才能修复。3切除修复(excision repairing)： 这是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。 *着色性

23、干皮病DNA的损伤和切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶AP核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶插入酶碱基取代4、重组修复(recombination repairing) 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。损伤部位不能除去，只能在世代连续过程中逐渐被稀释+重组交换+修复复制5、SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。 DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。 LexA是多种基因的抑制剂SOS反应的机制靶基因表达lexA靶基因表达 但产物被分解recA大量表达RecA促使分解LexA未诱导的细胞诱导的细胞靶基因lexA基因被Lex