010实验六细胞融合及血红细胞通透性

1、细胞融合红细胞膜渗透性观察细胞融合（cell fusion）又称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一重要手段，也是制备单克隆细胞株的重要技术。 细胞融合在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，形成双核或多核细胞（此时称同核体或异核体）。一、实验原理病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹

2、病毒等，其中仙台病毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。病毒诱导融合在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。聚乙二醇PEG诱导融合20世纪80年代建立起来

3、的电融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。 电融合电融合仪1. 器具: 显微镜 离心机 天平 离心管 细滴管 载片、盖片2. 试剂: 50%聚乙二醇(PEG)：称取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度试管，在酒精灯火或沸水中加热溶化。待冷至50时，加入等体积并预热至50的GKN液混匀。Alsver液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.

4、8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml重蒸水中。0.85%NaCl液二、实验用品三、实验内容及方法1.用注射器取2ml Alsver液，再从翼下静脉取鸭血2ml，注入管内，再加6ml Alsver液，混匀后置4冰箱中可备作3-4用。2. 实验时取“1”液1ml于离心管中，加入4ml 0.85%的NaCl液，混匀平衡后以1200rpm(revolution per minute) /min离心5分钟。3. 去上清液。再重

5、复“2”两次，最后一次离心10分钟。4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混匀使之成为细胞悬液。5. 在“4”液中加入68滴（约0.5ml）50%的PEG液，迅速混匀，常温下23min滴片镜检。四、结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸭血细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸭血细胞。五、融合率的计算 在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。作业：描述显微镜下细胞融合的变化，计算融合率。细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，它

6、可选择性地让某些物质进出细胞。而对于不同性质的物质，细胞膜的通透性是大不一样的。当细胞与所处的环境存在渗透压差别时，水分子可从渗透压低的一侧向高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，细胞会失水而皱缩；而在低渗环境中，细胞会吸水膨胀直至破裂。红细胞膜渗透性观察一、实验原理二、实验内容兔红细胞渗透压的观察1.取一小烧杯，用肝素液（1mg/ml生理盐水）湿润， 然后加入兔血，以10倍生理盐水稀释，制成兔血细 胞悬浮液.2.取5支试管，编码后依次向各试管加入1.5%NaCl液 5,3,2,1,0 ml,然后分别加入蒸馏水，使每管总体积 达到5ml，配成一浓度梯度的NaCl液。3.向每一试管加入0.5ml兔红细胞悬浮液，混匀。试管编号实验项目1.5% NaCl（ml） 5 3 2 1