植物组织培养技术

1、植物组织培养技术 主讲：蒋贵生概述什么是植物组织培养：植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。 植物组织培养流程图植物组织培养的过程可概括为： 脱分化 再分化 根、茎、叶外植体 愈伤组织 或 完整植物 胚状体 茎尖、茎段、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。植物组织培养原理：一是细胞的全能性；二是再生作用，与植物体分离的器官具有恢复完整植株的能

2、力。 组织培养类型：愈伤组织培养、器官培养、茎尖培养、原生质体培养、悬浮细胞培养。如花药培养：培养离体花药易获得单倍体植物。植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。植物脱毒及离体快繁，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，植物产品的工厂化生产等方面的研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。微繁有许多优势：繁殖速度快，通常一年内可以繁殖数以万计的，较为整齐一致的种苗，大大提高繁殖系数。特别对于难繁殖的园艺植物的名贵品种、稀有种质的繁殖推广具有重要意义。一个兰花的茎尖一年内可育成400万

3、个原球茎，一个草莓茎尖一年内可育出成苗3000万株。 占用空间小，一间30平方米的培养室可以放置一万多个瓶子，足以同时繁殖几万株种苗。可以培养脱毒种苗红芽芋种苗试管苗红芽芋栽培技术一、植物组织培养所需仪器设备1实验室：药品室、称量室、洗涤室、配剂室、消毒室、接种室、培养室等。2仪器设备：高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、电子天秤、酸度计、超净工作台、煤汽炉、铝锅等。3器械及用具：镊子、手术刀、接种针、细菌过滤器、牛皮纸、记号笔等。4玻璃器皿：三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒、容量瓶等。 培养室超净工作台培养架实验室二、培养基的制备1营养母液的配制在植物组织培养中，不同的植物，不同的器官和组

4、织，不同的研究目的，使用不同的培养基，培养基尽管千差万别，按其性质和含量来分主要由以下几部分组成：无机营养，包括大量元素和微量元素；有机物质；铁盐；碳水化合物；天然复合物；激素；琼脂（固体培养基）；其他添加物。在培养基的配制中，对各组分的成分，常先要按其需用量扩大一定倍数，配制成母液。 MS 培养基的配制配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液微量元素母液铁盐母液植物生长物质母液有机化合物母液MS大量元素母液（10X） 按扩大倍数分别称取各元素溶解后定溶在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液100ml。 化学药品 1升

5、量 10升量 NH4NO31650 mg/L165g KNO31900 mg/L190g CaCl22H2O 440 mg/L44g MgSO47H2O 370 mg/L37g KH2PO4170 mg/L17gMS微量元素母液（100X） 按扩大倍数称量溶解在1000ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。 化学药品 1升量 10升量 MnSO44H2O（ MnSO4H2O） 223 mg/L（214 mg/L） 223mg ZnSO47H2O 86 mg/L86mg CoCl26H2O 0025mg/L025mg CuSO45H2O 0025 mg/L025mg Na2MoO42H2O

6、025 mg/L25mg KI083 mg/L83 mg H3BO362 mg/L62 mgMS铁盐母液（100X） 按扩大倍数称量溶解在1000ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。 化学药品 1升量 10升量 Na2EDTA 373 mg/L373 mgFeSO47H2O 278 mg/L278 mg MS有机物母液（100X） 按扩大倍数称量溶解在1000ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。 化学药品 1升量 10升量 烟酸 05 mg/L5mg 盐酸吡哆素（VB6） 05 mg/L5mg 盐酸硫胺素（VB1） 肌醇 100 mg/L1 g 甘氨酸 2 mg/L20mg2、激素

7、母液配制各类激素用量极微，其母液一般配制成0.11mg/ml。有些激素配制母液时不溶于水，需经加热或用少量稀酸、稀碱及95%酒精溶解后再加水定容。常用激素类的溶解方法如下：萘乙酸（NAA）：先用热水或少量95%酒精溶解。吲哚丁酸（IBA）：先用少量95%酒精溶解后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）、（6-BA）：要先溶于1N盐酸。玉米素（ZT）先溶于95%酒精，再加热水。2,4D：需用1N NaOH溶解再定容。3、培养基的配制、分装及灭菌根据培养基的成分及用量，吸取各种母液，称取蔗糖（一般用量3%），加水至所需体积，待蔗糖全部溶解后，加入琼脂粉（一般6.58g/L），加热使琼脂完全熔化，

8、蒸馏水补齐溶液体积，用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度至pH5.8，分装在三角瓶或培养瓶中，高压灭菌（压力1.1Kg，温度121，时间1520min）。不耐高温的培养基成分，需过滤灭菌。四、外植体取材、消毒及接种1取材与消毒自大田取材或温室取材时应选取无病、无虫、生长健康的外植体。外植体表面消毒的一般程序为：外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。常用消毒剂的种类，使用浓度及消毒时间等见表。常用表面消毒剂使用浓度及效果消毒剂使用浓度持续时间效果去除难易升汞0.1-1%5-15分钟最好较难次氯酸钠2%5-30分钟很好易抗菌素4-50PPm30-60分钟比较好中双氧水10-

9、12%5-15分分钟最易2无菌操作（1）接种室消毒超净工作台面70%酒精试擦，打开紫外灯照射20分钟，进行无菌室及超净工作台杀菌。（2）材料的接种操作人员接种前必须剪除指甲，并用肥皂水洗手，接种前用70%酒精拭擦，接种时最好带口罩。接种时，必须在近火焰处打开培养容器的瓶口，并使瓶倾斜（瓶口低，瓶底高），以免空气中的微生物落入瓶内。3、无菌培养与观察接种后期材料放入培养室或培养箱内培养，温度一般为252，光照1016h，光强10002000勒克斯，有的材料需要暗培养。定期观察，继代培养（或转接培养）。五、植物组织培养程序与实例（一）初代培养1、初代培养要求：（1）保证无菌培养（2）培养条件适宜

10、（3）操作技术过关2、污染的防止（1）污染原因：一是培养基消毒不彻底，二是材料消毒不彻底，三是操作不当。（2）污染防除：一是培养基彻底消毒，二是材料表面严格消毒，三是操作熟练规范。（二）继代培养 继代培养一般使用固体培养，采取分株、切割嫩茎等方法进行扩大培养。继代培养础一般与初代培养基基本相同。但根据培养目的不同要进行调整。 （三）生根培养 当试管苗增殖到一定数量时要进行生根培养。配制生根培养基，即1/2MS+生长素。（四）试管苗移栽 试管苗移栽前须放在常温下的室内进行炼苗4-7天，使试管苗逐渐适应外界环境。移栽前1-2天打开瓶盖。移栽基质：河沙、至石、珍珠岩或砂加园土（1：2）。移栽前基质用杀菌剂进行消毒，并洗去苗基部粘着的培养，然后进行移栽。移栽完后要经常浇水，保持空气湿度90%以上，并遮光50%，一周后施一次营养液，如MS，0.1%尿素水等。待长出新叶后追施速效性肥，并可上盘。实例：（一）苹果茎尖培养1春季剪取5cm左右新梢茎尖，消毒后切取茎尖或带芽的茎段，接种在MS+2mg/L BA的培养基上培养诱导芽伸长。2把伸长的芽切段接种到MS+1mg/L BA+0.5mg/L K2N+2mg/L IAA的培养基上培养，获得丛生芽。3切取约2cm长的芽，浸入100mg/L IBA液体培养基中1530min，接种在1/2MS（蔗糖20g/L）的培养基