一轮复习 人教版　热点专题14　PCR技术及应用（29张） 课件

1、热点专题14PCR技术及应用热点归纳1概念PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制原则，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA。(2)耐高温的DNA聚合酶。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。(3)关于引物。概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为2030个核苷酸。作用：使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接接脱氧核苷酸，

2、见下图：(4)PCR(体外的DNA复制)的条件。控制温度，但不需解旋酶。DNA模板。原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，还提供能量。耐高温的DNA聚合酶。分别与两条模板链相结合的两种引物。需要在一定的缓冲液中进行。3PCR的过程(1)一般情况下，DNA模板链较长，需要PCR扩增的基因只是DNA模板链的一段。(2)第一轮循环，两引物与模板链互补，DNA分子模板链最长，新合成的DNA单链(含有引物的链)较短。(3)第二轮循环，以含有引物的母链为模板合成的DNA分子，会出现含有引物的DNA，其中新合成的单链b会比母链量更短，其实b就是我们所需扩增的目的基因的长度

3、，只是b为单链。(4)第三轮循环，以b为模板合成的DNA片段就是目的基因片段的长度。(5)结果分析。两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循环次数的增加，目的基因含量会不断增加。通过以上分析我们可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环产生的4个DNA分子)。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现，随着循环次数的增多，呈指数扩增。4PCR的应用现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序等。【典例】(2

4、021年山东师范大学附中高三开学考试)如果已知一小段 DNA 的序列，可采用 PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤用的EcoR主要存在于_生物中，限制酶存在于该类生物中的主要作用是_。(2)步骤用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的 3羟基与 5磷酸间形成_；PCR 每次循环一般可分为_ (按顺序书写)三步，其中第二步的目的是_。(3)若下表所列为已知的 DNA 序列和设计的一些 PCR 引物，步骤选用的 PCR 引物必须是_(从引物中选择，填编号)。(4)对 PCR 产物测序，经分析得到了片段 F 的完整序列。下列 DN

5、A 单链序列中(虚线处省略了部分核苷 酸序列)，结果正确的是_ _。A5AACTATGCGAGCCCTT3B5TTGATACGCCGAGTAC3C5GCAATGCGTTCGGGAA3D5AATTCCATGCTGAATT3【答案】(1)原核切割外源DNA，保证自身安全(2)磷酸二酯键变性、复性、延伸引物与两条模板DNA单链结合(3)(4)D【解析】(1)步骤用的EcoR是一种限制酶，主要存在于原核生物中，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，进而在特定部位将双链DNA切开，显然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保证自身安全。(2)步骤用的是 DNA 连接酶，DNA连接酶催化形成的是磷酸

6、二酯键，即催化相邻核苷酸之间的 3羟基与 5磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环包括变性、复性和延伸三步，该过程中升温到95 是为了使DNA变性解旋，进而获得DNA单链，其中第二步复性是指引物与两条模板DNA单链结合，进而为后续的延伸做准备。(3)由于DNA聚合酶只能从53方向催化子链延伸，根据碱基互补配对原则可知，引物是以目的基因下边一条链的左端为模板向右侧延伸，引物是以目的基因上边一条链为模板的右端向左侧延伸，引物是以目的基因下边那条链的右端为模板向右侧延伸，引物是以目的基因上边那条链的左端为模板向左侧延伸，本题的目的是要扩增已知序列两侧的未知序列，因此，应该选择引物和。(4)以下选项中，A、

7、B、C都是已知序列，只有D是未知序列，而要测定的是未知序列，故选D。解题指导熟知PCR扩增技术的原理、步骤和相关的技术流程是解答本题的关键，正确分析图示的信息是解答本题的前提，明确题意是解答本题的基础，碱基互补配对原则是解答本题的法宝。高考试练1(2021年广东罗湖区高三月考)基因工程中，需要用PCR技术获取大量目的基因，通常是利用质粒作为载体，将目的基因送入细胞中，PCR技术和对质粒的改造是基因工程中重要的技术过程。回答下列相关问题：(1)PCR过程中加热至9095 以后，需要冷却到5560 ，目的是_，在PCR反应体系需要加入引物，加入引物的原因是_。(2)一个DNA分子上有多个基因，现需

8、要获取其中某一个基因作为目的基因，在引物设计时，要将2种引物设计在_ _，此时_(酶)只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。(3)通常用质粒作为基因工程的载体，作为基因工程载体的质粒需要满足一些条件，现有两种质粒：质粒容易在物种之间转移，质粒不能在物种之间转移，应该选择_(选编号)作为基因工程的载体。(4)载体需要在受体细胞内能进行复制，同时能够控制自身复制，阐述控制自身复制的目的是_。【答案】(1)使得引物和模板结合DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从引物3端延伸DNA链(2)目的基因的上下游DNA聚合酶(3)(4)使目的基因在宿主细胞内保持相对适宜的水平【解析】(1)PCR由变

9、性、复性、延伸三个基本反应步骤构成，PCR中冷却到5560 ，这一步叫复性，目的是使得引物和模板结合。引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从引物3端延伸DNA链，因此在PCR反应体系需要加入引物。(2)利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增，一个DNA分子上有多个基因，现需要获取其中某一个基因作为目的基因，在引物设计时，要将2种引物设计在目的基因的上下游此时DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。(3)质粒作为基因工程常用载

10、体必须具备的三个条件：a能在宿主细胞内复制并稳定保存，b具有多个限制酶切位点方便剪切，c具有标记基因有利于检测。基因工程是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，因此载体需要容易在物种之间转移，因此应该选择作为基因工程的载体。(4)载体需要在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，同时能够控制自身复制，不能使目的基因过度复制，也不能让目的基因过少，因此控制自身复制的目的是使目的基因在宿主细胞内保持相对适宜的水平。2我国的新冠疫情防控已进入常态化阶段。研究发现，

11、新冠病毒主要通过S蛋白与受体ACE2结合侵染人体细胞。通过咽拭子取样进行RTPCR技术检测是目前临床上诊断新型冠状病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸检测的RTPCR试剂盒的部分工作原理简图如下。回答下列问题：(1)新冠病毒主要侵染人体肺部细胞，对机体其他部位细胞侵染能力较弱，根本原因是：_。(2)某科学团队利用体外培养的人肝癌细胞分离出新型冠状病毒毒株。体外培养人肝癌细胞时，应满足所需要的_的环境、一定的温度和pH、气体环境和_等条件，若使用合成培养基还需要添加_等一些天然成分。(3)RTPCR是指以病毒的RNA为模板合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。在此过程中，需要用到的酶有

12、_酶和_酶等。(4)利用RTPCR试剂盒对新型冠状病毒进行检测时，除借助上述RTPCR技术外，还需要用特异性探针。利用该探针对新型冠状病毒进行检测的原理是_。基因探针之所以能检测新型冠状病毒是因为其上含有_。【答案】(1)ACE2基因主要在人体肺部细胞表达(或在其他细胞中不表达或表达水平低)(2)无菌无毒营养血清(或血浆)(3)逆转录耐高温的DNA聚合酶(4)碱基互补配对新型冠状病毒的核苷酸序列【解析】(1)新冠病毒主要侵染人体肺部细胞，对机体其他部位细胞侵染能力较弱，根本原因是：机体内各种细胞的基因进行选择性表达，ACE2基因主要在人体肺部细胞表达(或在其他细胞中不表达或表达水平低)。(2)体外培养人肝癌细胞时，应满足所需要的无菌无毒的环境、一定的温度和pH、气体环境和营养等条件。若使用合成培养基还需要添加血清(或血浆)等一些天然成分，促进细胞更好地进行生命活动。(3)RTPCR是指以病毒的RNA为模板合成cDNA，故需使用逆转录