我这样的穷逼是如何做sirna

1、2015/12/7实验万事屋2015-12-01温馨提示：发“ 嗯” 可以查看标题下方蓝色“ 实验万事屋” ，或者之前的文章。的，添加关注后，我叫拿，是一个高科技的科学研发，要不是没经费，我差点就信了。课题是做一个的敲减，你会说，敲减有啥难的，去XX公司，去订一个敲减的慢，买三保一，做实验岗岗的。但是你真的是不理解穷的那你会说：，那就构建质粒啊，构建个shRNA的质粒，做个转染就行了。我只能呵呵你家质粒送我么？不送我买得起么？外切酶酶切不要钱啊？连接酶不要钱啊！你真的是太小看穷了。那你又会说：呃，的话，就去shRNA或者siRNA咯，有几家公司不错，我可以介绍给你，用lipo2000去转染就行

2、了。我只能耸耸肩，lipo2000？我连lipo20都没有！你根本就没把穷放在眼里啊！你是不是觉得，这也那也，我是不是基本就告别敲减了？绝壁不是这样的，穷会有穷的做法。没没质粒，没siRNA我照样做出来。用啥？还用啥，用我机智的大脑！把shRNA连接到T载体上去！既然要吧shRNA连接到T载体上去，那就还有一个问题，没有启动子啊怎么办？那就克隆一个咯！一般shRNA需要一个H1启动子。而H1启动子是可以用引物来克隆下来了。内本身就有的，直接抽个DNA就http:/s? biz=MzA3ODU1NjUyNw=&mid=401898214&idx=1&sn=533a0d39160e472b1f7e

3、1c777ab14073&s ene=1&s id=1207Kgait1/52015/12/7接着我要解决的是shRNA点这里。，shRNA的序列可以去SIGMA上搜到，具体的搜索方法就搜到shRNA之后，直接按照这个序列一条正向的shRNA的Oligo，然后再一条和这个反向互补的shRNA反义链的Oligo。引物了。就行了。回来做一个退火反应就可以那要怎么样才能把启动子和shRNA结合到一起呢？用PCR呗！这种方法叫做搭桥PCR。很简单就能搭起来，基本就是把H1启动子的反向引物上加上shRNA的一小部分同源序列，而http:/s? biz=MzA3ODU1NjUyNw=&mid=401898

4、214&idx=1&sn=533a0d39160e472b1f7e1c777ab14073&s ene=1&s id=1207Kgait2/52015/12/7喝彩的shRNA的正义链的5末端前，加上一部分H1启动子的序列，就像是这样：最终把连起来的产物用TA连接，连到T载体里去就行了，这样的T载应该可以表达shRNA了。但转染又是个问题，用不起Lipo2000，我只能用磷酸钙转染法来转染。先将DNA和CaCl2混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。http:/s? biz=MzA3ODU1NjUyNw=&m

5、id=401898214&idx=1&sn=533a0d39160e472b1f7e1c777ab14073&s ene=1&s id=1207Kgait 3/52015/12/7问题就是没有，转染效率低下。优点就是便宜，炒鸡便宜除了苦力，和不确定的风险，还有可能浪费的时间。大概用了不到500块钱就做一次敲减。谁说不能做高级实验了呢！这样的穷华丽丽的分割线博士：大拿的是很穷，账面上就几千块钱。但能想出这样的办法自己DIY一个简易的shRNA质粒，也真心是服了他了。这里提到的搭桥PCR技术，其实还是挺实用的，用这种方法不单单是做这样的连接，关键是可以在构建的过程中，做出一些点突变的位点。具体怎么做，这个就留给大家来思考吧，好了，今天就策到这里吧。万事屋出售的课程及服务（点击下方飘黄部分即可查看）分子生物学技术培训班 12月24-27日（)信号：zz76770309,：一分钟meta学习（还有个meta的群，点进去找大家吧，码也是问：zz76770309）http:/s? biz=MzA3ODU1NjUyNw=&mid=401898214&idx=1&sn=533a0d39160e472b1f7e1c777ab14073&s ene=1&sid=1207Kgait4/52015/12/7http:/s? biz=MzA3ODU1NjU