应用生物化学5-蛋白质组学-2-DE

1、蛋白质组学-双向电泳(Proteomics-2DE) 化学与生命科学学院One Genome Many ProteomesOne Genome Many Proteomes卵 毛蚴 母胞蚴 子胞蚴 成虫 童虫 尾蚴 （人、牛、鼠等）（钉螺）（钉螺）Central dogmaDNARNA蛋白质复制转录逆转录复制翻译中心法则基因表达调控From Genes to ProteinsSequence databasesWhat could happen+Gene ExpressiondatabasesWhat would happenProtein Expressiondatabases+What i

2、s happening蛋白质组(proteome)是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。 1. Concept 在人类基因组计划中大约有30,000个基因被鉴定出来。一个基因=平均4个左右的剪接变异体，约120,000或更多的独立蛋白。+翻译后修饰和蛋白相互作用，蛋白质组比基因组复杂10倍以上。 1. Concept Proteomics 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学

3、，其目的是从整体的角度分析细胞或组织内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得2. 双向电泳的实验原理双向电泳在第一向分离中蛋白质先按其等电点分开（isoelectric point pI值）。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白

4、质按其等电点分离的技术称为等电聚焦（IEF）。2. 双向电泳的实验原理 双向电泳的第二向电泳是在第一向垂直方向上进行SDS分离。 +pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等电聚焦+pH 3pH 7.5pH10pH 3pH 7.5pH10chargesize第二向：SDS电泳pIM.Wt.2-D ElectrophoresisPH 3PH 10Intuitive Spot Detection Wizard差别分析示意图Sample 1 aSample 1 bSample 1 cPresent in (

5、a) and (c) not (b)Present only in (a)Stronger in (b) than (a) or (c)First Dimension IEFSecond Dimension SDSGel StainingSpot ExcisionImaging and Analysis双向电泳流程Sample PreparationExcision / digestionDigestion ProtocolDe-stain50mM ammonium bicarbonate / 50% acetonitrileReduce10mM dithiothreitol in 100mM

6、 ammonium bicarbonate, 30 minutesAlkylate55mM iodoacetamide in 100mM ammonium bicarbonate, 20 minutesWash100mM ammontium bicarbonate（重碳酸铵）DehydrateAcetonitrile（乙晴）Digest6ng/uL Trypsin in 50 mM ammonium bicarbonate (25uL) , 5 hours at 37C全自动蛋白切取仪Mass spectrometry50007500100001250015000025507510002550

7、751000255075100025507510002550751000255075100500075001000012500ControlControlControlTreated15000TreatedTreatedMALDI-TOF-MS A Road Map to Discovery肽指纹图谱搜库AWPSGSAWPGYFRB1 1 MAERRVPFTF LTSPSWEPFR DWYHGSRLFD QSFGMPHIPE DWYKWPSGSA WPGYFRLLPS 61 ESALLPAPGS PYGRALSELS SGISEIRQSA DSWKVTLDVN HFAPEELVVK TKDNI

8、VEITG 121 KHEEKQDEHG FISRCFTRKY TLPPGVEATA VRSSLSPDGM LTVEAPLPKP AIQSSEITIP 181 VTVEAKKEEP AKKC说明：A显示HSP27的肽指纹图谱，其中匹配的肽段已标注肽段质量。B1-B4显示HSP27其中一个肽段的串级肽序列图谱，匹配序列以不同颜色显示。C显示HSP27的氨基酸序列，其中匹配的序列以下划线标出。LLPSESALLPAPGSPYGRB2VPFTFLTSPSWEPFRB33. 蛋白质组学与疾病研究 通过测定体液和组织的蛋白质组,我们可以寻找特异疾病的生物标记,即疾病特异性蛋白(disease speci

9、fic proteins, DSPs)。 DSPs水平的变化对于疾病诊断、治疗和判断愈后具有重要意义,还可以成为研究药物的药理或毒理作用的靶点。疾病的蛋白质组研究怎样利用蛋白质组学来开发药物?差异表达的蛋白提取蛋白质,进行结晶处理用x射线晶体衍射技术揭示蛋白质结构设计能够阻断蛋白质活性的药物为疾病的预后、诊断、预防和治疗奠定基础，最终目标是治疗靶向药物、合理设计药物和早期“标记”的鉴定。ProteomeProteomicsProtein进 展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis F

10、acility，APAF） 美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。 Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。 1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议 我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在

11、中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会 2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。Central dogmaNormal geneexpressionmRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表

12、达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome) 蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。表达蛋白质组(expressional)侧重于研究一个细胞或组织中所有蛋白质的表达状况，包括表达参考图谱的构建、蛋白质鉴定与数据库构建、蛋白质翻译后修饰和蛋白复合物结构的测定、以及不同生理或病理条件下蛋白质的比较分析等ProteomicsGenomicsTranscriptomicsSystems BiologyBioinformaticsStatisticsIntegrated view of the complex bio

13、logical systemsGel StainingFirst Dimension IEFSecond Dimension SDSImaging and AnalysisSpot ExcisionSample Preparation3. Proteomics Experimental Workflow蛋白质分子在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及侧链的游离基团而成为带电颗粒，并可在电场内移动，其移动方向取决于蛋白质分子所带静电荷。不同蛋白质分子根据其氨基酸组成及所在溶液的pH值，携带的静电荷不尽相同，致使它们在电场中的迁移率各异，从而达到分理的目的。（two-dimensional elect

14、rophoresis，2-DE） 将基因体或是由所取得的检体利用蛋白质体技术将其展现出来,可以对此生物功能获得较全面性资讯.当人类得到某种感染性疾病时,利用被感染者的血液或病变细胞当作检体,以蛋白质体方法分析与控制组间之差异性蛋白,筛选感染性微生物之标的蛋白质,利用这些标的蛋白质探讨其感染及代谢途径或是制造出诊断性抗体,相信这将成为研究感染性疾病的新标准模式. 1-1诊断标记 蛋白质组学可以用来分析体液中特殊的蛋白,来解说在疾病诊断上的影响,有助於对疾病成因的了解,病程的控制与研究判断预后的结果 .1-2 疾病诊断患有脑膜炎或是头部外伤的患者,可以取其脊髓液,透过双向电泳技术来鉴定蛋白质型态

15、患有呼吸窘迫的病人,因其胸腔充满液体而压迫到气管,可经由胸腔穿刺吸出该液体後便可减轻患者的症状,再利用双向电泳技术分析体液的成分 患有快速痴呆症者,已在其脊髓液中,检验发现两种不正常的蛋白 (命名为 130 和 131),最近被确定为 Tau g chain,此为临床上 CJD 所特有的病征. 蛋白质体学的研究也可以帮助我们去寻找新的疾病指标,相信在不久的将来将有助於监测疾病的进程,更进一步有助於疾病的治疗 1-3 新的疾病指标 扩大性心肌病变(Dilated cardiomyopathy, DCM )是一种严重的心脏疾病,也是现代繁 忙的都市人经常易患的疾病,最后将导致心脏失去功能;病人通常

16、都只能期待换心以维持生命. 运用蛋白质体的方法已经鉴定出心肌中150种蛋白质,比较后发现有25个蛋白质有明显的差异;经由这些已确认的蛋白质资料库与病人(或高危险群)的蛋白质做比对,或许可以在疾病产生初期达到早期预防的目的.心血管疾病 肺癌是最具肿瘤性 (oncological) 的疾病之一.临床上肺癌的诊断往往已属晚期.直至目前为止,并无有效的治疗方案可得.所以任何有助於肺癌诊断或预後的发展都是有助於肺癌的治疗方针的. 因此,许多科学家致力于以双向电泳技术研究肺癌.在分析组织病理学上不同种类的肺癌细胞时,结果发现不同组织病理类型细胞体会有不同的蛋白质表现图谱. 另外,发现有一种专一性的蛋白质仅

17、会出现在原发性肺腺癌上.例用此技术将可有效地鉴定出新的肿瘤标志 (tumor marker),在鉴别诊断麟状上皮细胞肺癌与腺癌时有相当大的助益. 肺癌 人类的肾脏癌是较少见的癌症,其中源自於近端肾小管上皮细胞的肾细胞癌大约占成人恶性肿瘤的3 %.但如同许多实质性肿瘤般,肾细胞癌发现时期均属癌症末期,外科手术已难治愈的阶段.并且无适当的肿瘤标志可参考. 科学家在用双向电泳技术研究肾脏癌组织的研究中发现有四种蛋白质的表现在肾癌细胞中会消失. 虽然该研究没有发现特定的标志蛋白质.但尚有许多可能与该癌症发生相关的蛋白质仍待被鉴定.肾脏癌在比较人类正常乳房组织与恶性乳房癌的蛋白质分布中,发现两者之间有专

18、一性的蛋白质差异存在.在肿瘤细胞中,至少有 22 种蛋白质会不正常的增加,一种蛋白质则会减少.另外也发现到某些特定的蛋白质的表现与 estrogen 与 progesterone 接受器之间有相关连性.乳癌 结肠癌是一种常见的癌症.利用双向电泳与免疫转渍技术,分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋白质中分离出的一系列蛋白质.并将有意义之蛋白质点切割出,进行蛋白质序列分析以鉴定这些蛋白质 结果发现 hsp 70 酸性的 isoforms 在结肠息肉 (polypous) 与恶性组织 (malignant tissues) 中的表现不论是在量上或质上均有相当的差异;此外在慢性发炎性肠炎的黏膜或 Crohns 肠炎组织中