纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析

1、实验纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析一、实验目的了解各环境因素（如：温度、pH值等）对酶稳定性的影响。了解衡量酶稳定性的指标：半衰期T1/2。二、实验原理酶的稳定性常用半衰期（T1/2:一定条件下酶活力丧失50%所需的时间）来衡量。一般来说半衰 期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型令时间为t时活性酶的浓度为E,酶活性为A，则有:d EV = k E E dt d tE = E Dexp( 一 k t) ln E = ln E 一 k t ln A = In A - k tIn -b = k tAd t(2) ln 2T1/ 2A ,根据式（1），以

2、lnT对处理时间t作图其斜率即为kd。进而通过式（2）便可求得半衰期（T1/2）。 t实验材料、试剂、仪器材 料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。试剂：0.5 mol/L NaOH。仪器；pH计、离心管、金属浴四、实验步骤酸性条件下溶菌酶的稳定性稀释5倍75 C纯化溶菌酶分装离心管（0.5mL/管）分别处理0,10, 20, 40, 60 min保温冷却至室温测酶活碱性条件下溶菌酶的稳定性稀释5倍75 C纯化溶菌酶调pH值调至8.0左右一-分装离心管（0.5mL/管）分别保温冷却至室温处理 0, 10, 20, 40, 60 min测酶活酶活的测定及计算方法方法：玻璃比色杯快速混匀底物悬

3、浮液2.0mL加入0.05mL酶液f测人心风皿值1min内的变化（】5s记录一次）计算：采用自定义酶活性单位（U）：当前测定条件下，测定体系在450 nm波长下吸光度每分钟下降0.01所需的酶量为1个酶活力单位（U）。酶活力a （U/mD = AA450nm/（L0 min x顷x酶液体积）。五、实验结果与分析：观察加热处理中酶液的变化情况（如沉淀的出现）。加热处理中，本组的酶液用肉眼观察，变化不太明显，浑浊度微微大了一些。以“相对活力”对“加热处理时间”作图。表1酸性条件下溶菌酶酶活力处理组010min20min40min60min0s0.6810.6320.5870.5370.55115s

4、0.5980.5870.5160.4680.49930s0.5430.5260.4620.4190.45845s0.4920.4540.4150.3770.4260s0.4490.3950.3750.340.381A450nm0.2320.2370.2120.1970.17酶活力（U/mL）464474424394340相对活力（）100102.1551791.3793184.91473.27586表2碱性条件下溶菌酶酶活力处理组010min20min40min60min0s0.5870.5680.5890.6420.68615s0.4870.480.5050.5620.63930s0.409

5、0.4250.4510.5110.59945s0.3240.3830.4080.4760.56260s0.2580.3440.3680.4440.531fnm0.3290.2240.2210.1980.155酶活力（U/mL）658448442396310相对活力（）10068.0851167.1732560.1823747.11246不同pH条件处理不同时间的相对酶活变化酸性条件相对酶活一碱性条件相对酶活204060处理时间（min）80图1酸碱条件处理不同时间的相对酶活变化以ln。0对处理时间t作图，其斜率即为k，进而便可求得半衰期（T化）。， Ad1/2t图2酸碱条件处理后的斜率图由图2

6、可看出，两条方程的拟合效果不太理想，相对系数均小于0.95。且酸性条件的斜率k1=0.0055， 碱性条件的斜率k2=0.0104，k1 T”（碱），说明溶菌酶在经过碱处理后， 酶活丧失得更快，这与事实是相符的。比较两者酶液热稳定性的差异，并分析环境pH值条件对酶分子热稳定性影响的原因。根据表1、2所得数据，做出图1。由图1可以看出：（1）鸡蛋清溶菌酶较稳定。即使在75C下处理 60min，酸性下仍有73.28%的相对酶活，碱性下也还有47.1%。（2）从两条曲线的趋势可以看出，溶菌酶 在酸性条件下更加稳定，处理2060min时的相对酶活均较高；碱性条件下，溶菌酶的相对酶活随着时间 的增加而逐渐下降。pH值条件对酶分子热稳定性影响的原因：在温度不变的前提下，（1） pH过小（过酸）或过大（过 碱）都能使酶蛋白变性而失活，使其热稳定性下降。（2）pH的改变能影响酶活性中心基团的解离程度， 同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化。但应该注意，酶的最 适pH不是一个常数，它的大小与底物的种类和浓度、缓冲液的性质和浓度、介质的离子浓度