流式细胞仪原理 与临床应用

1、流式细胞仪8/6/20221中国科技大学生命科学实验中心 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。8/6/20222中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的特点单个细胞分析同时多参数分析速度快：10000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞8/6/20223中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的原理流式细胞仪的应用流式细胞仪的数据处理8/6/20224中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的工作原理8/6/20225中国科技大学生命科学实验中心流式细胞术（Flow Cytometry,

2、简称FCM,又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量工作原理8/6/20226中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统8/6/20227中国科技大学生命科学实验中心Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid8/6/20228中国科技大学生命科学实验中心 细胞被

3、戴上特殊的标记。所用的标记细胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子。8/6/20229中国科技大学生命科学实验中心荧光染料及其发射波长FITC 525nmPE 575nmPI 630nm自发荧光与特异荧光8/6/202210中国科技大学生命科学实验中心抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：一般不

4、提倡用8/6/202211中国科技大学生命科学实验中心实验对照的设计空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时8/6/202212中国科技大学生命科学实验中心实验标本的处理单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体8/6/202213中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的样品要求单细胞悬液被检细胞或颗粒大小0.280um样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升8/6/202214中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的

5、光学系统激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm and紫外光UV。光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成，将产生的光信号引导至检测器8/6/202215中国科技大学生命科学实验中心Forward Angle Light ScatterFALS SensorLaser8/6/202216中国科技大学生命科学实验中心90 Degree Light ScatterFALS S

6、ensor90LS SensorLaser8/6/202217中国科技大学生命科学实验中心Dichroic Filter/MirrorFilter placed at 45oReflected lightTransmitted LightLight Source8/6/202218中国科技大学生命科学实验中心LaserFluorescence DetectorsFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)Purdue University Cytometry Laboratories8/6/202219中国科技大学生

7、命科学实验中心流式细胞仪的光学系统8/6/202220中国科技大学生命科学实验中心 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。8/6/202221中国科技大学生命科学实验中心1 流式细胞仪的散射光信号FSC:表示细胞大小SSC：表示细胞内颗粒的复杂程度8/6/202222中国科技大学

8、生命科学实验中心外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）8/6/202223中国科技大学生命科学实验中心2，荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强8/6/202224中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的电子系统进行信号检测和分析当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、 作

9、图、 统计分析8/6/202225中国科技大学生命科学实验中心 当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器(interference detector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。细胞分选的原理8/6/202226中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪分选系统488 nm laser+-Charged PlatesSingl

10、e cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector8/6/202227中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的应用8/6/202228中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的科研应用细胞表型分析胞内细胞因子的检测染色体分类研究细胞周期和DNA倍体分析流式标准小球定量分选细胞内钙离子测量8/6/202229中国科技大学生命科学实验中心8/6/202230中国科技大学生命科学实验中心How to analyze soluble proteins in FCM?+Antigen (cytokines)Fluorescence D

11、etector antibodyCapture beads Capture antibodyBeads8/6/202231中国科技大学生命科学实验中心Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.8/6/202232中国科技大学生命科学实验中心Beads Pro

12、vide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensitiesDifferent colors with different intensities8/6/202233中国科技大学生命科学实验中心Example 6-bead assayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture BeadsLysate or SupernatantSampleDetector Antibod

13、iesWashAnalyze on flow cytometer8/6/202234中国科技大学生命科学实验中心CBA Standard curves8/6/202235中国科技大学生命科学实验中心流式细胞术的临床应用白血病免疫分型HLA-B27: 强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（CD55、CD59）血小板活化试验8/6/202236中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的数据处理8/6/202237中国科技大学生命科学实验中心数据处理 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。

14、对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。8/6/202238中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪数据分析（1）直方图分析8/6/202239中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪数据分析（2）点图分析8/6/202240中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪数据分析（3）等高图和密度图分析8/6/202241中国科技大学生命科学实验中心Gating8/6/202242中国科技大学生命科学实验中心Compensation8/6/202243中国科技大学生命科学实验中心compensation8/6/202244中国科技大学

15、生命科学实验中心8/6/202245中国科技大学生命科学实验中心G0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of EventsA typical DNA Histogram of cell proliferation8/6/202246中国科技大学生命科学实验中心细胞凋亡检测技术1 几个概念2 技术和方法8/6/202247中国科技大学生命科学实验中心1 荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分 2 DNA指数(DI)：相对DNA含量3异倍体：非二倍体，包括近二倍体，四倍体，多倍体，非整倍体8/6/202248中国科技大学生命科学实验中心凋亡细胞的特点在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。细胞坏死时，细胞肿胀，FSC增大，SSC也增大8/6/202249中国科技大学生命科学实验中心Annexin V/PI双染活细胞为（Annexin V-/PI-） 坏死细胞为（Annexin