细胞培养-第2章

1、 第二章体外细胞培养的基本要求 第一节 体外培养的生存条件一、严格的无污染(无菌无毒)环境无化学物质污染无微生物污染无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(抗体、补体等)二、合适的生存环境恒定适宜的温度 细胞培养的的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受解剖部位体温差异的影响，如皮肤温度低于骨骼肌的温度。 大多数人和哺乳动物细胞系适合温度是3537；鸟类和禽类细胞温度要求较高，为38.5， 37 时生长缓慢；昆虫细胞的最佳生长温度为27；冷血动物的细胞系可耐受的温度范围较广(1526)。 细胞对低温的耐受比高温的耐受强，与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题，因此通常将培养箱的

2、温度设定为略低于最佳温度。 培养细胞置4下数小时后，恢复到37细胞仍能良好生长。 低温冷冻技术可长期保存细胞。气相环境细胞生存所需的气体主要有O2和 CO2 多数细胞缺O2不能生存，但高氧环境对细胞毒性作用较大。 由于培养基的pH值取决于溶解态CO2和碳酸氢盐HCO3-间的精密平衡，因此培养环境中二氧化碳含量的变化会改变培养基的pH值。CO2主要维持培养液的pH，细胞代谢产生的CO2，释放至培养液使培养液变酸。为维持培养液pH值的恒定，常在培养用液中加入NaHCO3。 pH 大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH7.4，而且不同细胞系间差异极小。有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境(7.07.2)中

3、生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境(7.47.7)。昆虫细胞系最适pH值为6.2。总体而言细胞耐酸比耐碱强，在偏酸性环境中更有利于生长。 液相环境(渗透压)： 指各种平衡盐溶或培养液的等渗状态，细胞必须生活在等渗的环境中，不同细胞的理想渗透压不同。人血浆渗透压约290mOsm/kg，可视为培养人体的理想渗透压。对大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围均适宜。 三、合适的营养条件营养成分：与体内基本相同，主要包括： 1. 氨基酸 所有细胞都需要以下12种必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪

4、氨酸和缬氨酸，这些氨基酸均为型。 此外，所有细胞都需要谷氨酰胺，谷氨酰胺在细胞代谢过程中具有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，也是合成磷酸腺苷所需的基本物质。 2. 单糖 主要为6碳糖，是细胞代谢的能量来源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，细胞对各种糖的吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。 3. 无机离子与微量元素：基本元素和微量元素，非培养液固定成分，实验研究中，通常加入不同微量元素，观察对培养细胞的影响。 4. 维生素：在细胞代谢过程中主要扮演辅酶、辅基的作用，必不可少。 促生长因子及激素：主要来源于血清，对于维持细胞功能、保持细胞状态十分重要。各种生长因子的作用明显

5、并具有特异性，激素类物质也具有促进细胞生长增殖的作用。 促细胞贴附物质：体外贴附型细胞在生长过程中，多需要促细胞贴附物质，不同种类的促细胞贴附物质具有不同的促细胞贴附特性。 第二节 培养用液培养用液主要包括： 营养液 缓冲液 平衡盐溶液 血清 消化液 pH调整液 抗生素一、水和平衡盐溶液培养用水： 体外培养细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。 配制培养用液应用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水。 通常不用去离子水，因含有机物和非离子物质。 制备的水存放时间不宜太长，一般不超过2周。平衡盐溶液(Balance Salt Solution ，BSS) 主要由无机盐、葡萄糖组成，主要作用是维持细胞

6、渗透压平衡，保持pH值稳定并提供简单的营养。多用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其它试剂等。平衡盐溶液的配制也需应用双蒸水或去离子水；若配方中含有 Ca2+、Mg2+，应当首先溶解，配制好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高压蒸气灭菌。常用的BSS是Hanks液和Earle液： D-Hanks：NaHCO3量较少，缓冲能力较弱，宜利用空气平衡。 Earle液：含有高浓度NaHCO3，缓冲能力较强，需用5%CO2维持平衡。 注意： 配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无Ca 2+、Mg 2+的D-Hanks液 平衡盐溶液多配制成10贮存液。二、培养液： 与培养基的含义几乎相同，英文均为me

7、dium，按来源分：（一）天然培养基(Natural Medium) 主要指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基，如血清、血浆、淋巴液及鸡胚浸出液等。含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、 pH等也与体内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大。 二. 培养液： 与培养基的含义几乎相同，英文均为medium，按来源分：（一）天然培养基(Natural Medium) 主要指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基，如血清、血浆、淋巴液及鸡胚浸出液等。含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、 pH等也与体内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大。

8、组织浸出液：早期动物细胞培养中应用的天然培养基，主要成分为大分子蛋白(有利于细胞的分化)和小分子氨基酸(促细胞分裂增殖)，如鸡胚浸出液和牛胚浸出液等。 水解乳蛋白：为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基，可用于许多细胞系和原代细胞的培养。 动物血清：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素以及无机物等。绝大多数动物细胞的培养需要使用动物血清。可起作用： 提供细胞生长和增殖所必须的基本营养物质如各种氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等。 补充基础培养液中没有或量不足的营养成分，血清中含有多种激素和生

9、长因子。 促进细胞贴附的基质成分，如血清中的纤连蛋白和层粘连蛋白可促进细胞贴壁。 有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用，如硒、SeO3。 含蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞死亡时 释放蛋白酶的作用；血清蛋白形成了血清的黏度，可保护细胞免受机械损伤。 提供结合蛋白，携带重要的低分子量的物质，如白蛋白携带维生素、脂肪酸、胆固醇以及激素，转铁蛋白携带铁。 不足之处： 存在不利于细胞生长和繁殖的物质，如补体和免疫球蛋白。 血清成分不明确，影响结果分析。 不同动物，不同批次的血清成分和活性差别较大，造成培养结果不稳定。 有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（如成纤维细胞）同时抑制

10、另一类细胞的生长（如表皮角质细胞）。 取材过程中有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞产生潜在的影响，导致实验失败或实验结果的不可靠性。 血清的质量标准： 血清质量的高低取决于两方面的因素：一是取材对象，二是取材的过程。血清质量的鉴定一般包括以下几个方面： 理化性质 如渗透压、 pH、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平以及内毒素等，其中球蛋白（主要是抗体）含量是一项非常重要的指标，含量越低血清质量越高，血红蛋白含量也是越低越好。 微生物检测 包括细菌、真菌、支原体和病毒等。 促生长效果 是血清最重要的特性之一，应以培养的细胞来检测。与标准对照血清比较。 血清质量判断： 外观好的血清透明清亮，土黄色

11、或棕黄色，无沉淀或极少量沉淀，较粘稠。如血清浑浊、不透明、多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白变性；若呈棕红色说明血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。如要进一步了解血清的内在质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞的生长状况。 血清的种类： 牛血清：胎牛血清 剖宫产的胎牛 新生牛血清 出生24h内 小牛血清 出生10-30天 人血清、马血清 鸡血清、兔和羊血清(同种细胞的特殊培养) 单牛血清、混合血清 选择牛血清的原因：来源充足，制备技术成熟、经过长时间的应用对其了解深入。 以GIBCO公司出售的牛血清为例，胎牛血清取自剖腹产的胎牛，新生牛血清取

12、自出生24h之内的新生牛；小牛血清取自出生1030天的小牛。胎牛未接触外界环境，血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少，因此胎牛血清的品质最高。 注意： 血清中补体成分对某些细胞有毒性作用，应56，30 min灭活。 血清长期保存应在-20以下。 分装成小瓶使用，避免反复冻融。 使用浓度： 合成培养基不加血清能维持细胞短期生存 维持液(25%血清) 细胞生长液(1020%血清) 不明成分对分析实验结果增加了困难 无血清培养基的应用。 鼠尾胶原：从严格意义上讲不是一种培养基，不能够提供细胞生长所需要的营养物质，其主要作用是促进贴附型细胞的贴壁，特别是对上皮型细胞。从动物特定组织中用人工

13、方法提取，通常用大鼠尾腱制备。 制备方法：大鼠尾腱称重后剪碎按每克50ml的比例加入0.1%的醋酸溶液摇晃使尾腱分散于醋酸溶液中，4浸泡一周4000r/min离心1015min吸取上清即为鼠尾胶原，分装至小瓶，4保存备用。 使用方法： 用吸管将胶原均匀涂于无菌的培养瓶细胞生长面，胶原层不宜太厚，以没有液滴为准。 培养瓶通入氨气或用浸有氨水的棉球封口片刻，氨气充于瓶内后用胶塞塞紧。 待胶原和氨气作用30min，胶原凝固，然后用生理盐水或Hanks液冲洗，凉干后即可使用。（二）合成培养基 是根据细胞在体内生存的条件，将细胞体外生长所需物质的种类按一定量严格配制而成。最初研制合成培养基的目的，就是希

14、望能完全替代天然培养基，但结果却没有象人们预期的那样。许多合成培养基只能维持体外培养细胞的短期生存，只有在添加适量天然培养基后，细胞才能在其中长期生长发育，同时发现原来针对某一种细胞研制的培养基也适合于许多其它细胞。 1. 基本成分 最低限量基础培养基(minimum essential media，MEM)只含有20多种细胞体外生长必不可少的基本成分，基本成分包括四大类物质： 无机盐：CaCl2, KCl, NaH2PO4 , NaCl, NaHCO3, MgSO4 氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸 维生素：偏多酸钙、

15、氯化胆碱、叶酸、核黄素、硫胺素、吡哆醛等 糖类：葡萄糖 2. 种类 几十种之多，常用的只有7、8种。 经典的Eagle MEM养基，仅含12种必需氨基酸、谷氨酰胺、8种维生素和必要的无机盐，成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。 DMEM（Dulbeccos modified Eagles medium）：为诺贝尔奖金获得者Dulbecco R.改良的Eagle培养基，多用于哺乳动物与人细胞系的培养。分为高糖型和低糖型。 RPMI-1640：最初是由Moor等为小鼠白血病细胞培养而设计，开始的配方特别适合悬浮细胞的生长，主要针对淋巴细胞，经几次改良，从RPMI-1630、RPM

16、I-1634，最后至RPMI-1640。其组分较为简单，后来发现适用于多种细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代细胞或传代培养的细胞，是目前应用最为广泛的培养基之一。 HamF12：使用了Cu2+、Zn2+和Fe2+等微量元素，适应在血清含量较低的情况下的细胞培养，有利于培养细胞的分化，也适用于克隆化培养。是无血清培养基中常用的基础培养基。 McCoys 5A 是一种专门为肉瘤细胞设计的培养基，后来发现它特别适合于原代细胞的培养以及较难培养细胞的生长。 3. 培养液的配制 认真阅读说明书，注意粉剂中不包含的成分，主要是NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES，其中NaHCO3、谷氨酰胺是必

17、须添加的。 保证充分溶解， NaHCO3、谷氨酰胺都要在培养基完全溶解后才能添加。 所用器皿应十分洁净。 配制好的培养基应马上过滤，4保存。 培养基粉剂+三蒸水充分溶解采用微孔滤膜(直径0.22m)滤过除菌 细胞生长液：1020%小牛血清 细胞维持液：25%小 牛血清，1%抗生素(100g /ml链霉素，100u/ml青霉素) (三) 无血清培养基(Serum free medium, SFM) 不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 特点： 成分明确，可以排除含血清培养时许多未知因素的干扰。 在生物制品生产中，应用无血清培养基，可以提供生物制品的质量和纯度，产物易分离

18、纯化。 不足之处，一是成本较高，二是无血清培养基针对性强，一种无血清培养仅适用于某一类细胞的培养，目前尚无普遍 适用的无血清培养基。 基础液：HamF12和DMEM按1:1混合 + 15mM HEPES和1.2g/L NaHCO填加组分: 促贴附物质：许多细胞必须贴附瓶壁才能生长，因此无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般是细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。 促生长因子和激素：针对不同的细胞添加不同的生长因子。 蛋白酶抑制剂：最常用的是大豆胰酶抑制剂。 结合蛋白和转运蛋白：常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的添加量较大，可增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤。 微量元素

19、：硒最为常用。 注意：对水要求更高，必须是用玻璃蒸馏器经3次蒸馏所制备的水，或者超纯水装置制备的超纯水，制备后即刻应用。 无血清培养的使用方法： 细胞转入无血清培养基需要一个过程。 在逐步降低血清的过程中要注意观察是否发生变化，是否有部分细胞发生死亡。 注意观察存活细胞是否保持原有的生物学特性。 细胞在转入无血清培养基培养之前应保存种细胞，按常规培养与含血清培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 (四) 培养基的选择 经验法：根据文献报道和来自各实验室的材料，已被证明的合适培养可查到。 实验法：用96孔细胞培养板做一组克隆形成率和细胞生长曲线，根据实验结果选择最佳培养基。三、其他常用液体(一)

20、消化液 在原代细胞培养中，用于从组织块中分离出单个细胞；传代培养时使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞。 常用胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)，可单独使用，也可按一定比例混合后使用。根据细胞的要求，自行试验以作取舍。1. 胰蛋白酶溶液 主要从牛或猪的胰脏提取。易潮解，冷暗干燥保存。 可水解细胞间起连接作用的蛋白成分，使细胞相互离散。 不同组织或细胞系，同一细胞系不同生长时期对胰蛋白酶的作用反应不同；换言之，胰蛋白酶对细胞的离散作用与细胞类型和细胞特性密切相关。 胰蛋白酶分散细胞的活性与其浓度、温度和作用时间等有关，一般来说浓度大、 温度高、作用时间越长，对细胞的分离 能力越大，但超过一

21、定的限度也会损伤细胞。pH8.0，37时作用能力最强(注意调整pH)。 常用浓度为0.25%，0.125%，作用温度分 37, 4及室温，消化时间从数分钟到数小时不等，用D-Hanks液配制，因钙、镁离子可降低其活性。 配制时需4，overnight，并不时振荡滤纸粗滤过滤除菌。 消化细胞时，加入血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止其对细胞的继续作用。2.EDTA溶液(Versen液) 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散 作用。毒性小，价格低廉，使用方便。 常与胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可单独使用，常用浓度为0.02%. 用无Ca2+、Mg2+液体溶解，高压蒸汽灭菌，4保存。

22、 3.胶原酶溶液 从溶组织梭状芽胞杆菌提取制备，有1、2、3、4和肝细胞胶原酶5 种。实验时可根据不同组织细胞类型选用不同的胶原。(二)消化酶抑制剂 贴壁生长的细胞传代时须用消化液，在含血清培养时，血清中某些成分可中止消化酶对细胞的作用。而无血清培养时则必须使用消化酶抑制剂，以保护细胞免受残留的消化酶的损害。目前常用的是大豆胰酶抑制剂，两种使用方法： 在胰酶作用后的单层细胞加抑制剂 将抑制剂加入Serum-free medium. (三) pH调整液1.NaHCO3 配制营养液时不预先加入，使用前再加入。单独配制、消毒灭菌。 常用浓度7.4%、5.6%和3.7%。 三蒸水配制。 滤过除菌或10

23、磅10min高压蒸汽灭菌，分装后4或室温保存。 调节培养液pH时，应逐滴加入，并不时搅动，避免过量。如溶液内有酚红指示剂，可按颜色变化判定。 pH超过后，可用10%醋酸溶液或CO2气体调节。2.HEPES液 是一种弱酸，氢离子缓冲剂，对细胞无毒性，防止培养基pH的迅速变动。缓冲能力强，能较长时间控制恒定的pH范围。使用最终浓度为1050mM。 双蒸水溶解，NaOH调pH至7.58.0. 通常配制成500mM浓度，过滤除菌后，分装后室温或4保存；也可按所需浓度，直接加入到配制的营养液内，再过滤除菌。(四)抗生素液 预防性的加入适量抗生素，1%的双抗或三抗(青霉素100u/ml、链霉素100g/m

24、l、卡那霉素和庆大霉素)，配制成100的贮存液，分装小瓶，冷冻保存。必要时加抗真菌药物。(五)谷氨酰胺溶液 溶液中不稳定，4下放置7d即可分解约50%，若培养液在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺溶液，使用浓度14mm/L。 第三节 体外培养细胞的附着底物和 抑制因素一、附着底物 细胞贴附在底物上生长的性质呈锚着依赖性。 凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，但不同细胞对底物要求各异。 (一) 玻璃 在较长一段时期最为常用。 优点：透明、便于观察、易洗涤、能反复使用，适于各种细胞附着生长。 缺点：易碎，一些细胞不易贴附。 (二)一次性塑料 聚苯乙烯:有疏水性，光洁平坦，适用于多种细胞的培

25、养。使用方便，一次使用。 聚四氟乙烯:透气性好，可制成薄膜，剪成小块后置于各种瓶皿中，细胞贴附生长后，可取出染色或做成电镜切片。(1)充电荷，具有亲水性， 适用于单层细胞培养。 (2)非充电荷，具有疏水性， 适合巨噬细胞和转化 细胞培养。 (三) 微载体 由聚苯乙烯或聚丙烯酰氨制成的小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞。 (四) 饲细胞(Feeder cells) 也称滋养细胞，通常成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但仍能存活并有代谢活动。可作为支持物，然后接种上其他细胞，饲细胞的代谢产物利于其他细胞生长，用于某些特殊难培养细胞的培养。二、抑制细胞生长的因素

26、 有毒物质：化学物质 微生物污染：细菌、真菌、支原体等 球蛋白：可能含有与培养物发生交叉反应的抗体 血清灭活：能除去补体和降低Ig的毒性，但不损伤多肽生长因子。但可能消灭另一些更有用的成分。 第四节 细胞培养所需设施和设备 细胞系的建立、传代和贮存 培养液的配制 相关实验(免疫学、分子生物学和细胞生 物学实验，以及某种特定目的的实验等) 一、无菌室、超净工作台无菌室是相对密封、防尘、防菌的工作空间，其基本条件：环境清洁、空气清新，无微生物污染，不受其他有害因素影响，便于隔离、操作、灭菌和观察。一定的密闭性好、通风透气性好、容易消毒、使用方便。设计原则：细胞培养实验室与其他辅助实验室必须分开；各

27、个实验室的布局要统一、协调、方便操作；室内各项设备安排要紧凑，以节省空间，减少活动；避免交叉干扰。理想的无菌室应由更衣间、缓冲间和操作间组成。超净工作台 安装方便，操作简单，占据空间小，使用效果好。 原理：采用鼓风机驱动空气通过高效过滤器使空气净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，形成无菌的工作区。同时，在接近外部处形成一道高速流动的气帘防止外部带菌尘空气进入。 二、设备仪器 恒温培养箱 目前常用的为CO2培养箱，可恒定地提供一定浓度的CO2(2%5%)；维持培养液较稳定的pH值。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水

28、结合形成碳酸，培养基pH很快下降。开放式培养采用NaHCO3- CO2缓冲系统，一方面能使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养容器；另一方面可通过稳定调节培养箱CO2的浓度，使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。NaHCO3H2O-NaHOH2OCO2 应用CO2培养箱须注意： 维持一定的CO2浓度 保证开放式培养(通气) 定期消毒(内置紫外灯、酒精) 一定的湿度，避免培养液蒸发倒置显微镜 最好带有摄影和保温装置，动态记录结果或附有荧光装置。 目的：了解细胞生长情况，以便及时处理；观察是否发生污染和污染类型。 冷冻装置 普通冰箱4(培养液、缓冲液和消化液等) 低温冰箱-20-30(血清、酶和抗

29、生素等) 超低温冰箱-70-90 液氮容器-196，长期保存细胞 纯水装置 细胞培养对水质的要求极高，通常使用三蒸水或超纯水装置制备的超纯水配制各种液体。 颗粒制冰机液氮罐超纯水仪 电热干燥箱 主要用于烘干和干热消毒玻璃器皿 离心机 低速离心机 5005000r/m, 可离心0.550ml样品，主要用于收集细胞。 高速离心机 10000r/m以上，用于分子生物学实验。 高压蒸汽消毒装置 恒温水浴箱 预热细胞培养所用的各种液体。电热干燥箱台式低温离心机低温离心机台式离心机高压灭菌器恒温水浴锅恒温水浴锅 过滤除菌装置 正压抽滤装置 负压抽滤装置 一次性微孔滤膜滤器 滤膜的孔径0.8m、0.45m、0.22m和0.1m等几种，除菌需要采用0.22m滤膜。正压滤器负压过滤装置负压过滤装置一次性针式滤器 其他常用仪器设备 电子天平 一般组织培养用0.11mg感量的