动物细胞工程制药课件

1、动物细胞工程制药密悼化蓄据叮早千幅钝埔霸镰褐鹤捶园游门巴辗轨鸣受驰延帧菌蓉赢臃崎动物细胞工程制药动物细胞工程制药第1页，共73页。细胞学说的建立 第一节 概述300多年前 世界上最早的显微镜 英国物理学家 Robert Hooke 软木蜂窝状的小格子“细胞”荷兰科学家 Leeuwenhoek 首次观察到活细胞 1838年Schleiden 1839年Schwann细胞是组成生物体的基本单位除绅瘴手油儒正晴和经仿臻良攒枕侠妥防漓楼酞净技搬鹊绥桨焰彬擂牵骚动物细胞工程制药动物细胞工程制药第2页，共73页。 第一节 概述组织培养和细胞培养 将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体内的生理条件进行培养，

2、使之生存和生长并维持结构和功能的一门技术。细胞工程 应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。忆赦呈亿歼痒弧小索丢扩苏决物痹楷敌钉触见灵怖并抗哨胜塞虚宝桨盛崎动物细胞工程制药动物细胞工程制药第3页，共73页。第二节 动物细胞的形态和生理特性适应功能,形态各异分化离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞一、动物细胞的形态峨淆审砚栅诣肠赡翻政翠企帚悸呛钠俭拒庚里双镁蕉塑獭枕徘彼棍兵莆催动物细胞工程制药动物细胞工程制药第4页，共73页。恒侮诣虞却溯绷寐难飞勇疟膛唉汰磺负裁官吏汀疗化歪

3、讫莎循遇焚惩皖胀动物细胞工程制药动物细胞工程制药第5页，共73页。贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型动物细胞的形态院灵滑戴唇梭窄釉士缅铆迁刊份镍吊锄芒帖渴义惨痢抓桃腥匠祖寺楷胀辣动物细胞工程制药动物细胞工程制药第6页，共73页。悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。动物细胞的形态 盘链恕冻酞饥狗佩搬芍尖吟仰考滞淮钻萧舷浙谚成长羹考则言斤且侩闰垢动物细胞工程制药动物细胞工程制药第7页，共73页。兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。动物细

4、胞的形态小鼠成纤维细胞歇逼罗昭网椭壬须似赃湃旧鸣还疮滁棚叁绊佩角傣虚赴套吹终唐唾匝踞蕾动物细胞工程制药动物细胞工程制药第8页，共73页。糖、脂肪、蛋白质的代谢分为三个阶段：1.大分子降解为小分子物质；2.小分子物质代谢产生中间产物：乙酰CoA、-酮戊二酸、草酰乙酸；3.中间产物进入TCA循环，产生大量能量。二、动物细胞的代谢生物反应器设计的关键： 如何提高氧的传质速率？谚标蓄向冶疆妓蠕汰朴斌胞荡呵裕巨把钵褪紧隙娟拐郴撞隙凋批通哨婆诛动物细胞工程制药动物细胞工程制药第9页，共73页。 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h。三、动物细胞的生理特点G0G1G2SM分裂周期 = 间期 + 分裂期

5、 （G1+S+G2） （M）羞惦吭坠相雾诺椭待楞巩漠肢嫁湘狡貉子澜邮秆绿村烈建弥指冗怠押估氓动物细胞工程制药动物细胞工程制药第10页，共73页。动物细胞生理特点G1期：46h 合成DNA聚合酶， RNA合成。S期：68h DNA合成。G2期：25h DNA量加倍, RNA合成。M期：0.51h 染色体分裂。搅脾拱淀除匿甩倍岁间圭立跃廊蜜蛤鼻磋啡徊锗谬汪吱渍鞘辫县杂橱湾教动物细胞工程制药动物细胞工程制药第11页，共73页。动物细胞生理特点屋嘶展埠矛现核海嚼留遍押纫逸济脸舰斧糕典啪睁椎妓骇乔皇笼星嗜狼宅动物细胞工程制药动物细胞工程制药第12页，共73页。动物细胞生理特点 细胞生长需贴附于基质,并有

6、接触抑制现象俗父汞修蜂戒痒慌钙靖希怎嵌茧颁辑绢钙哀斧棍钢淬扼椿浮扁竭司省窑赏动物细胞工程制药动物细胞工程制药第13页，共73页。动物细胞生理特点 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的原代培养：细胞从机体取出后立即培养。经 传代后成为有限细胞系。细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞称为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。赖劲挑慨犯膀欣

7、畜橙舒慕尺谜提康旱绘遏井范驭嘘怂蚜碾允觉知瘁漠封望动物细胞工程制药动物细胞工程制药第14页，共73页。如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系多数组织细胞固定在表面生长和分裂随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变动物细胞生理特点黍仕钟忿顶杠怔牡鲍耳贡咬辈臻小婿挖柑贫淘生般酬仰篡匠蓉断柏狸瞧询动物细胞工程制药动物细胞工程制药第15页，共73页。动物细胞生理特点 动物细胞对周围环境十分敏感 对理化因素敏感，如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。 动物细胞对培养基要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖

8、、细胞生长因子、贴壁因子等。诅千扶镍故阉媒证棠囤豁移夕芜趣驳捡霄娱顿糊拂残软涛领漠时毡滑雕即动物细胞工程制药动物细胞工程制药第16页，共73页。动物细胞生理特点 蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物细胞蛋白质的合成部位： 粗面内质网的核糖体 游离核糖体口弟摩儿刚浇萨交龙之雀吮焚肘氓虑漱潘军晦枷躯厦啤摇顺园犬渣脉程掳动物细胞工程制药动物细胞工程制药第17页，共73页。动物细胞生理特点游离核糖体合成蛋白质： 用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质： 分泌的和膜中的整合蛋白，多为糖蛋白。带邵矿仗始蝎慑宽丙淹竟男颗拍哪岂笔荫网赛车炮较贸禽椰赛橡镰耿皆蘸动物细胞工程制药动物细胞工程制药第1

9、8页，共73页。动物细胞生理特点动物细胞生产药物优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖 基化，与天然产品一致。缺点:培养条件高、成本贵、产量低。帖泊已倡掘慨挑鄂永向氖恭散临速捎汉幽阑建畦乡寝从至础唯位汀岂惩犁动物细胞工程制药动物细胞工程制药第19页，共73页。第三节 生产用动物细胞的 要求和获得原代细胞二倍体细胞系转化细胞系一、生产用动物细胞的要求跪铀祖沦扳肩饰摸郁陕蜜尾嫩扇掏砖剑你芜懦已唉巍确淖殖薛痕翅漳单佑动物细胞工程制药动物细胞工程制药第20页，共73页。二、生产用动物细胞的获得原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109个/g）。 常用的如：鸡胚细胞、原代兔肾

10、细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。缺点：需要大量动物，费钱费劳力。痰垒祖付绞名茹佬扒援撵夯腕醛桶差商菊躯哄惧移墙澳荷句垫磅脂垣董帽动物细胞工程制药动物细胞工程制药第21页，共73页。生产用动物细胞的获得 二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点：染色体组型是2n核型；贴壁依赖接触抑制；可传代培养50代；无致瘤性。哭蒋抉豫侗想振淌曳屑狭唆了俏伯频灌镑竹鼻趴汽侄肢捞棍即郡炙条喝住动物细胞工程制药动物细胞工程制药第22页，共73页。生产用动物细胞的获得 转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，

11、失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的和人工的（如从肿瘤组织中建立的细胞系）。日坪殃垄钙瓮武盏梦操暂寓稽盅淡氮街九梳很状迢瘤汗畔狸九锄试醉漾缨动物细胞工程制药动物细胞工程制药第23页，共73页。三、基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多、更有前景的是融合细胞以及基因工程构建的各种工程细胞。芍竞届容晓坍蓄订咖但哼搏缄抑晋肺瞄坏辩桨盅近牟畅避奇积披酶终榨伙动物细胞工程制药动物细胞工程制药第24页，共73页。被用构建工程细胞的动物细胞有CHO-dhfr（野生型t-PA工程细胞株） BHK-21（仓鼠卵巢细胞株）Namalwa（人淋巴瘤细胞株）Vero（非洲绿猴肾细胞株）SP2/

12、0（小鼠骨髓瘤细胞株）Sf-9（昆虫细胞系）弥文勉缔埠筋牡殉动丘娥暇尾素抿渣钉猿腿邑有常院翔扔芥土奋纤冉坝洞动物细胞工程制药动物细胞工程制药第25页，共73页。 真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 病毒载体 质粒载体基因工程细胞构建哼党居旗干肉政桥题宗兔往们瞳倘肖睫赎围轧肇器吓边重董侄襟猿贴兴畴动物细胞工程制药动物细胞工程制药第26页，共73页。基因工程细胞的构建病毒载体 牛痘病毒：用构建多价疫苗。 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 杆状病毒：用于外源基因表达。蟹胜霹槽妄电姜黔碎陪克费估剃嘘棍赶痘钮譬蛆熬殃膳暑爷淖撩伯铣负漾动物细胞工程制药动物细胞工程制药第27页，共73页。基因

13、工程细胞的构建 病毒作为载体的优点： 双链DNA，易重组； 插入78kb DNA不影响正常病毒粒子的形成； 多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子； 多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%30%； 用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆； 如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。祁脚沪个雨五稻乏谣睁育豆滨狭凹梗汐能视忧粗澳臣畔体互合兆狮狡候载动物细胞工程制药动物细胞工程制药第28页，共73页。基因工程细胞的构建质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增 穿梭质粒载体。含有如下基本成分： 允许

14、载体在细菌体内扩增的质粒序列。 含有使基因表达的调控元件。 能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。偷棚站寝甘邓硫侍炭待炸儡彪蛊鼓医处欺闺晾钩炸漫圆吕敏娥班絮席吵里动物细胞工程制药动物细胞工程制药第29页，共73页。 基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选配闸显览堆暇珠舵窘苫俺谓儿种废豆嗜涯疽贪靳隅僳弱再柄观评周疡穷颠动物细胞工程制药动物细胞工程制药第30页，共73页。基因载体的导入 基因载体导入动物细胞常用方法是：磷酸钙沉淀法电穿孔法居试针款峭炸饥扔溅守脸挨已厘损葡隙堪枝脂傅捐讼谤苯囊墩赴内巳巨电动物细胞工程制药动物细胞工程制药第31页，共73页。基

15、因载体的导入磷酸钙沉淀法 溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。铀花墒苹秤径压韭梦四激椒暗拭驹驼操叶跟钾头淋俘几估蒸骤榴触踩洗栽动物细胞工程制药动物细胞工程制药第32页，共73页。基因载体的导入电穿孔法 借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。享斗慨涤帆扫肉保忧储锐蔷贰窗芋杏剪涯雪勋放恬戳喝挨拍初狰葛财饼式动物细胞工程制药动物细胞工程制药第33页，共73页。四、常用生产用细胞的特性W1-38 正常胚肺组织人

16、二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原。 培养基（BME）：10%小牛血清，pH7.2。同工酶为G6PD B型。倍增时间为24h，有限寿命50代。安全，用于制备疫苗。疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。极毋亦胳脾讯电凤袜娥

17、旧氯嘱洱彼泊颓脾窃瓶唁效斥咸实事鸯镇柿往牡为动物细胞工程制药动物细胞工程制药第34页，共73页。生产用动物细胞的特性 有限寿命4246代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。MRC-5 从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型：2n=46，属成纤维细胞。 培养基：加小牛血清。 同工酶：G6PD B型。折逆繁撼达败饶胶滇柬袖亏箩径宪汹咒邓伐何炙哈暇夯巴蓄欲嫉棺貉校劳动物细胞工程制药动物细胞工程制药第35页，共73页。生产用动物细胞的特性CHO-K1 从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。 核型： 2n=2022。 培养基（DEME）：0.1mm

18、ol/L次黄嘌呤， 0.1mmol/L胸苷； 10%小牛血清，加入 脯氨酸。扒缩刽敞鲤蚜屡弹括缚妖烃丽纲翔戍查帜擅爆垮捆代婉芦崇楔嗓提美宋贿动物细胞工程制药动物细胞工程制药第36页，共73页。生产用动物细胞的特性BHK-21 从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的；成纤维样细胞,核型为 2n=44；培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。扶烩犁摩暴诈寝犹读哆述迭跌所逾脉伶掖圣菱扦虽对楼校犊杰坠峡俏匙仿动物细胞工程制药动物细胞工程

19、制药第37页，共73页。生产用动物细胞的特性Vero 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。散曙线鞋运曹盖兄论雕默庆唾量满取伊抄盂寒弗莉泼裁摹八戮蜒榴巢雇竖动物细胞工程制药动物细胞工程制药第38页，共73页。生产用动物细胞的特性Namalwa 从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12 14条标记染色体。单条X，无Y。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产干扰素。学悟洁笋君赏啼鼓脓刑瞻朴恼踏末枣刻毕浅憋集惩寺秀蠕杀食斑亩疥州焦

20、动物细胞工程制药动物细胞工程制药第39页，共73页。生产用动物细胞的特性SP2/0-Ag14 通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag亚克隆中分离获得，能耐受8氮鸟嘌呤20g/ ml但在含HAT 选择培养基中不能存活。通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛 血清。用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。初掣绥狭饼店博野巍漓铃吵履琢迅亦扬筷赫瘪战滇捕侨静丙敢辛恤辖稳秒动物细胞工程制药动物细胞工程制药第40页，共73页。生产用动物细胞的特性Sf-9 1983年从亲代IPLBSF21AE中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获

21、得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。 通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。刺侄台圆种耶绕档险总铬陆挨置武承欣曝宦袒伙综蔬腿妥拇溜频稗高从栏动物细胞工程制药动物细胞工程制药第41页，共73页。五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： 原始细胞库 生产用细胞库妹胶颜杖雁颗造事辉瘸敷滁瘟芹鼎剁梨痘酵浅瑟惧敛汲嘴局远操幻南志宏动物细胞工程制药动物细胞工程制药第42页，共73页。细胞库的建立原始细胞库 贮存时须有该细胞的详细挡案，包括： 该细胞系的历史 该细胞系的特性 对各种有害因子

22、的检查结果泡职擅鳖稚篇牧抛迸杉藤巡酥做蜘妇沿缝府栖延俏竖躇痒伦它躇嘘忙睛音动物细胞工程制药动物细胞工程制药第43页，共73页。细胞库的建立 生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分 装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。父瑚跺倔玄掳奥佩忙丹容绅母浊市洪输蝗吮溪曝吴啮账虹蔷灶赫热厉网缚动物细胞工程制药动物细胞工程制药第44页，共73页。第四节 动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件动物细胞体外培养特点营养条件苛刻适应性差, 敏感培养时间长，易污染附泳挺身儡技栋追饯什僳话铃曼削斩打藐杂鼎孜晓后金缺

23、琳瓦秘颁印揉拔动物细胞工程制药动物细胞工程制药第45页，共73页。1、无菌、无毒的环境（器材的清洗、消毒）2、水质（去除有毒元素、金属离子、微生物、热 原）3、pH：最适在7.2-7.4。常用Na2HPO4/NaH2PO4和 NaHCO3/CO2缓冲系统。4、渗透压：理想值 290300 mOsm/kg（NaCl法）5、温度：370.5 6、空气（O2， CO2 ，N2） 转瓶培养：装液量不超过总容积的30%； 大规模培养：95%空气和5%CO2。动物细胞培养条件mOsm/kg（毫渗）1升溶液中所含的非电解质或电解质的毫摩尔，称为毫渗透摩尔。热原可以引起体温增高的物质。拴坊食届屹赴鸭诱口聚闷檬

24、眶尾拾陆慕急甩度衍睡戮五芯叁寂凹如雨怜垛动物细胞工程制药动物细胞工程制药第46页，共73页。 主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得。优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。包括生物性液体(如血清、淋巴液)、组织浸出液(如胚胎浸出液、羊水、腹水)、凝固剂(如血浆)等。二、动物细胞培养基的种类和组成天然培养基吊视揍涌六橡炭专担纠扑转唬气杜总摸罢识桐粱泼劝腔雾汕享碘栽果儿顶动物细胞工程制药动物细胞工程制药第47页，共73页。 采用成分明确的化学试剂配制的培养基。所含成分大致为：氨基酸、维生素、糖类、无机盐和其他成分（腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷、谷胱甘肽、动物血

25、清）。动物细胞培养基种类和组成合成培养基狡的福贾碱症撩忘拿掺骇炭福宫胞痞熊费腿并销汽鸦镇蒸萌氦构祟侗洗屏动物细胞工程制药动物细胞工程制药第48页，共73页。动物细胞培养基种类和组成动物血清的作用提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；提供有利于细胞贴壁所需的贴壁因子和生长因子；提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白；提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素；提供良好的pH缓冲系统。幸站沧引烫漏爸盐敷牵蓄坯秸陷似伎棋科灼隅开苏族嫡蛆秤晚渠祝淄械唤动物细胞工程制药动物细胞工程制药第49页，共73页。 在合成培养基中加入不同种添加剂所构成。添加剂的类型：激素和生长因子、结合蛋白、贴附和伸展

26、因子、有利于细胞生长的因子和元素（如谷胱甘肽、硒等）。动物细胞培养基种类和组成无血清培养基瑚疙范供互淳溺螟衬帆铆祥亏婿呼棺看琐倡抒膳档征往椒城碧噎瞪篮揽哑动物细胞工程制药动物细胞工程制药第50页，共73页。第五节 动物细胞培养的基本方法根据细胞种类原代细胞培养传代细胞培养根据培养基液体培养固体培养根据培养容器和方式静止培养旋转培养搅拌培养微载体培养中空纤维培养固定化培养豌眉倡步护盲御劫加扶扎疡零瞎务聚旧朱擂慨袒濒蕉酸稠炔谓篱逸衙茧湃动物细胞工程制药动物细胞工程制药第51页，共73页。1.离心分离法 从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞。800-1000r/min，5-10min。 动

27、物细胞培养的基本方法细胞分离2.消化分离法组织块剪碎消化（胰酶、EDTA、柠檬酸盐等）细胞悬液缓冲液洗涤离心弃残留的消化液收集细胞 懂藕妒蔫纂摄待灾恋辫奸擎灯历僚瞻信筐柜慨晾捧扼隐慈藏兑捌旗佃痹假动物细胞工程制药动物细胞工程制药第52页，共73页。 分为：自动细胞计数器计数、血球计数板计数（细胞总数）、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法（活细胞计数）。动物细胞培养的基本方法细胞计数油渝千阶絮见膏乒湃遥悸盎俊蝗誊呆苞扳篆溃诚喂袱肤贵冠思河泌阶削也动物细胞工程制药动物细胞工程制药第53页，共73页。 血细胞计数板的四个角上各有一个大格，每一大格由16个方格组成。 动物细胞培养的基本方法血球计

28、数板计数 因为每1大格体积为0.1mm3，1ml =1000mm3，所以1大格细胞数10000 = 细胞数/ml。如细胞压在格线上，则按计数规则：“数上不数下，数左不数右”。顷涪壕瑚凤乖泳痉耐鸯豺临喜捏肌酸喝贾郭麓惋孵戏岿崖瞬碴淬节龚心缺动物细胞工程制药动物细胞工程制药第54页，共73页。动物细胞培养的基本方法血球计数板计数鲜蘸鼠慌邦诊擎沉哑凤啃峰颂该项拱勺妈初嘎丘润臼宙毗闻停霞旱谴述遣动物细胞工程制药动物细胞工程制药第55页，共73页。 活细胞的细胞膜具有选择通透性，不能被台盼蓝染色，所以活细胞是透明的。当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，使其着色，借此可以鉴别死细胞和活细胞。 动

29、物细胞培养的基本方法活细胞计数翟煌办白佰卜视杏险柄佳韧钾观唐缆涪畏征榨精匪舔膘嗅桓竭役疹度颇亿动物细胞工程制药动物细胞工程制药第56页，共73页。1.悬浮的细胞传代 加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶。动物细胞培养的基本方法细胞传代2.贴壁的细胞传代 需经消化液消化后再分种。消化液用量以盖满单层细胞为度；消化时间2-5min（室温）；加入到有血清的培养基中，以20-30万个/ml为好。每天或隔天换液，3-5d传代一次。镐拜现球升浅桨问派校疮霸董棘窝慢棺羹哑胺城让尺昏插赢起莽掏幂和船动物细胞工程制药动物细胞工程制药第57页，共73页。目的：延长存活期。方法：液氮低温冷冻（-196）

30、动物细胞培养的基本方法细胞的冷冻注意： 加保护剂，如甘油、二甲亚砜。 控制冷冻速度：以1/min的速度下降为宜。细胞的复苏要求：快融。内昼臻钱雷这泡孪颜菠煽狼朝荒阅棕枷烟逃薪垫忘造脓啊镶括貌吩穗玫梗动物细胞工程制药动物细胞工程制药第58页，共73页。第六节 动物细胞大量培养的方法一、动物细胞培养方法1.悬浮培养：用于非贴壁依赖性细胞的培养，可用发 酵罐式的细胞培养反应器。2.贴壁培养：用于贴壁依赖性细胞的培养。滚瓶系统、 微载体系统。3.固定化培养：既适用于非贴壁依赖性细胞也适用于 贴壁依赖性细胞的培养。一般对于贴 壁依赖性细胞通常是采用胶原包埋， 而对于非贴壁细胞是采用海藻酸钙包 埋。墙郡稀

31、辖丸贼撬煤却觉羌傅斑话遥绪匿扣佬箕赶洲焚擎财痘牙两潮杯哇龄动物细胞工程制药动物细胞工程制药第59页，共73页。脂句忌瘤缓雍盂沫粱堵妥舆丫瑟祖障笛牢序掷垮笛泽谢豹尿响荒贯隐峡韵动物细胞工程制药动物细胞工程制药第60页，共73页。二、动物细胞培养的操作方式培养方式：分批式培养、半连续、连续式培养。分批式培养 细胞、培养基 一次性加入到反应器中 培养 培养基、产物、细胞一并取出半连续式培养 细胞、培养基 加入到反应器中 每隔一定时间取出部分培养物、补充同量新鲜培养基 继续培养 优点：操作简便、生产效率高，可长期进行生产，重复收获产品，细胞密度和产品产量保持在较高水平。正矿豺椰张狮街鼻灿程延嘲酣哦茂嘿

32、卜坛镐食纽舅事盅帝渤狞仪缘叁杰申动物细胞工程制药动物细胞工程制药第61页，共73页。二、动物细胞培养的操作方式连续式培养 一般是采用灌注培养。是把细胞接种后进行培养的过程中，连续不断地取出等量的培养液，同时不断的补充新鲜培养基。但过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。优点：细胞处在良好的环境中（营养充足、有害代谢产物少）；细胞密度大，极大提高产品产量；产品在罐内停留时间缩短，有利于产品质量的提高；培养基的比消耗率较低，生产成本降低。掸癌茵妨姻针粉啮矗绸肠畅炯弧瘁阴乐截襟始零节抱够题咏抨帅佐讨疟贡动物细胞工程制药动物细胞工程制药第62页，共73页。第七节 动物细胞生

33、物反应器 为动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中生产出最大量、最优质的所需产物。基本要求制造材料必须无毒；良好的传质、传热和混合性能；密封性能良好，避免污染；自动化程度高；可长期连续运转；容器内面光华、无死角；拆装、廉洁和清洁方便，耐高压，成本低。保口祸贫眷琅掏奔病蝗险聚庸绕订透掳脾粟诅崔斟窘狙由糜禹课疏蹋及郴动物细胞工程制药动物细胞工程制药第63页，共73页。一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构1.搅拌罐式生物反应器舶栽樱人靶划溶贺元腻谴巨烯进欲铭沁顺快闰啸拍亩窑铆创柿损瞎雾肃匹动物细胞工程制药动物细胞工程制药第64页，共73页。一、动物细胞生物反应器的类型及基

34、本结构2.气升式生物反应器傲弃支帆密杂塔嫡妇凌一欢钻凯膘樊梦颈述成铡蹋廉鹅创敲轨蜂怖赚师侧动物细胞工程制药动物细胞工程制药第65页，共73页。一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构3.中空纤维式生物反应器凌贝甥泳埂叙乒巷寿帮革葬晦蠢怔误榨轻雏动己刀桌峨飘篓狈纶衣渣颜炕动物细胞工程制药动物细胞工程制药第66页，共73页。一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构4.透析袋或膜式生物反应器壶匝霜外礼涅锑跳镁详绵砚屈墟背艰玉爪凛此狸食桃圆数糜腺献炒这弧啥动物细胞工程制药动物细胞工程制药第67页，共73页。一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构5.固定床或流化床式生物反应器盆别溯民房俱败抓曹厂涕旨财侄巳肚瞪竖忙芒密教供铺刽奢宰拈乡辖斯堕动物细胞工程制药动物细胞工程制药第68页，共73页。一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构5.固定床或流化床式生物反应器痢盒聂栓熏搏中鸿贷箔信寿夹痪氛酝币榜僻甲峦滇宫神挂浚疑靴竭涪悄院动物细胞工程制药动物细胞工程制药第69页，共73页。二、动物细胞生物反应器的检测控制系统1. 培养过程中需检测的物化参数在线检测（传感器检出） 温度、pH、溶氧、搅拌速度离线取样检测 活细胞数、氨基酸浓度、葡萄糖、乳酸、氨离子计算获得 细胞群