RTPCR和realtimePCR原理及步骤课件

1、RT-PCR和real-time PCR 原理及步骤第1页，共27页。PCR定义聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。 第2页，共27页。PCR原理 10扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水第3页，共27页。逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增RT-PCR原理第4页，共27页。1.总RN

2、A的提取。（试剂盒说明）RT-PCR基本步骤BufferdNTP混合物引物总RNA逆转录酶DEPC水（试剂盒说明）2.逆转录合成cDNA。3.PCR及跑胶。ddH2O10mM dNTP10PCR bufferMgcl2上游引物下游引物模板cDNATaq 酶第5页，共27页。Real-time PCR原理通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 A

3、mplifluor (Intergen)第6页，共27页。第7页，共27页。第8页，共27页。第9页，共27页。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 第10页，共27页。定量PCR的数学原理第11页，共27页。第12页，共27页。斜率与扩增效率第13页，共27页。第14页，共27页。标准品第15页，共27页。标准品梯度稀释方法第16页，共27页。1、SYBR Green

4、法第17页，共27页。SYBR Green 熔解曲线分析第18页，共27页。SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜第19页，共27页。Taqman 的优点对目标序列有很高的特异性 特别适合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设计相 对简单Taqman 的缺点价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析 分子信标的优点对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 荧光背景低分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高 其他荧光标记方法第20页，共27页

5、。绝对定量与相对定量的定义第21页，共27页。绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究第22页，共27页。绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物第23页，共27页。相对定量通过内标定量内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在

6、细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量第24页，共27页。相对定量分析方法1 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值第25页，共27页。相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度第26页，共27页。样品DNA纯度：OD260/OD2