体内药物分析方法建立和验证

1、关于体内药物分析方法的建立与验证1第一张，PPT共一百页，创作于2022年6月2第一节 分析方法的设计依据 在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，系统检索国内外的科技文献，对药物在生物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文献。 检索文献，可在最短时间、最小的花费（磨刀不误砍柴工）建立一个好的分析方法！这是试验前要做的第一件事！大四的同学们，你们查过文献吗？第二张，PPT共一百页，创作于2022年6月3血药浓度 94-2008 5122篇第三张，PPT共一百页，创作于2022年6月4第

2、四张，PPT共一百页，创作于2022年6月5第五张，PPT共一百页，创作于2022年6月61992年创刊的中国临床药学杂志 2001年第二军医大学长海医院主办的药学服务与研究两刊于2004年同时成为中国科技核心期刊 临床药学专业性的学术期刊有：第六张，PPT共一百页，创作于2022年6月7不想当将军的士兵不是好士兵 容量大的U盘：中国临床药学杂志、药学服务与研究中大量的相关文献拷贝下来 另外以 “临床药学”、“临床药师”、“合理用药”、“药学监护”、“血药浓度”等为关键词，查找相关的文献，copy !看文献 写论文 提职称第七张，PPT共一百页，创作于2022年6月8这门课有两个实验，要求大家

3、以论文的形式写实验报告！实验一 改进的柱前衍生-HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度 由老师提供文献。看完文献后，考虑一个问题：该如何设计、优化实验条件？实验二 姜黄素-PVP固体分散体在兔体内的药代动力学参数的测定 大家到图书馆电子阅览室查阅文献！ 关键词：姜黄素，血药浓度 或：姜黄素 ，（药代）动力学 要看PDF 文档，电脑要安装 ADOBE READER软件 第八张，PPT共一百页，创作于2022年6月9一、待测药物的理化性质及体内存在状况 准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物通过一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中释放出来。故此，应首先考虑样品预处理方法待测药物的理化性质药物在

4、生物体内的存在状况药物在生物体内的生物转化(代谢)途径建立分析检测方法的主要依据有：第九张，PPT共一百页，创作于2022年6月10(一)待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等决定预处理方法及萃取方法具有亲脂性在适当的pH值下用溶剂萃取具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等具有挥发性GC测定法具有光谱或电化学特性分析检测方法药物的稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定避免高温蒸发溶剂-一个例子第十张，PPT共一百页，创作于2022年6月11另一个“两弹一星”：拯救5亿人的“中国神药” -青蒿素 疟疾是危害人类最大的疾

5、病之一。全球每年疟疾病人超过5亿，死亡100万人以上。屠呦呦：古医书中有青蒿治疗疟疾的记录。起初青蒿的有机溶剂提取物对疟疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古医书： “青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。” 和中药常用的煎熬法不同？原来里面用的是青蒿鲜汁！ 改用沸点较低的乙醚提取，抑制率达100% 温度！第十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月12(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法 指标：提取回收率蛋白结合较强（非极性强）不宜直接采用溶剂萃取 ？有机溶剂没选对？吲哒帕胺、伪麻黄碱！体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物决定分析检测技术浓度较低（尤其有代

6、谢产物共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用HPLC或LC-MS等分析检测技术 第十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月13二、分析测定的目的与要求 体内药物分析的目的影响分析方法的应用药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物要求同时测定原形药物和代谢产物 检测宽线性范围(CmaxCmax的1/20，4-5半衰期)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)方法不必强调方法的简便、快速，按SOP，大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS建立分析检测方法的主要依据有：第十

7、三张，PPT共一百页，创作于2022年6月14二、分析测定的目的与要求 临床治疗药物监测 药物浓度通常在有效治疗浓度范围附近方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定，大多采用UV、RIA或EIA等。？中毒患者的临床抢救 药物浓度极高方法不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA ？第十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月15三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用以血浆或血清为分析样品采用蛋白沉淀、溶剂萃取预处理技术分析样品较为“干净”，可用HPLC检测用RIA分析 ？FPIA法样品的预

8、处理方法可较为粗放经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月16四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。 此外，还应从方法的可行性、每个样品测定耗时多少（10 min）、操作的难易及技术要求及仪器、设备要求、费用多少等等方面加以考虑。第十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月17 在阿齐霉素制剂生物等效性研究过程中，血样中阿齐霉素的浓度范围为5 ng/ ml1g/ ml ，其检测方法可采用HPLC 法、LC-MS 法和微生物法等数种方法。若用HPLC 法来检

9、测该样品，由于阿齐霉素的紫外吸收较弱，必须对样品进行富集浓缩，则样品的前处理方法采用液-液萃取法为佳；若用LC-MS 法来检测该样品，则由于LC-MS 仪器的灵敏度足以检测浓度为1ng/ml 以上的样品，故样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法来检测该样品，则样品连蛋白也不需沉淀，直接上样即可。 例子 1第十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月18 当然，用LC-MS 法来检测阿齐霉素时，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法来处理血样，这些做法虽然行得通，但显然它们不但增加了样品处理的所需时间和工作量，而且增加了样品处理的成本，因此阿齐霉素的血

10、样处理最好采用蛋白沉淀法。第十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月19 蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样品的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不稳定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考虑到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，且该方法阿齐霉素的回收率较高，故阿齐霉素血浆样品的前处理方法以乙腈沉淀蛋白法为最佳。第十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月20 如果测定的是血清中头孢拉定的浓度，头孢拉定为-内酰胺类抗生素，对酸稳定，且酸有利于头孢拉定的提取。蛋白沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀法了。-具体问题具体分析 -信息，查文献例子 2第二十张，PPT共一百页，创

11、作于2022年6月21第二节 分析方法建立的一般步骤 一、分析方法的选择二、分析方法的建立(一)检测条件的筛选(二) 分离条件的筛选第二十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月22一、分析方法的选择体内药物分析方法的设计受多种因素影响生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少难以通过增加取样量提高方法灵敏度通过选择适当的分析方法适应样品分析需求。常用分析方法的检测限度及分离能力见表4-1第二十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月23摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 二五年三月 SFDA颁布（一）常用分析方法（1）色谱法：气

12、相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱质谱联用法（LCMS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。 从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法，如HPLC、GC法或LCMS、GCMS法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，多数实验室也具备条件，因此应用最广，大约90%的药物浓度测定可以用色谱法来完成。具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法多

13、方面因素来考虑确定。第二十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月24二、分析方法的建立初步拟定分析方法后进行一系列试验工作，以选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性，以确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第二十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月25(一)检测条件的筛选 标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度HPLC 调整检测器(类型、条件) 、色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)、流动相(组分及其配比)及其流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使

14、各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ ) 良好的色谱参数(n、R、T) 适当的保留时间(tR)第二十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月26(二)分离条件的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)2空白生物基质试验 (方法特异性)3模拟生物样品试验 方法效能指标4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性)第二十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月271空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）测定响

15、应信号（如HPLC峰面积或峰高）考察目标方法的特异性空白值应尽可能小，并能有效校正第二十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月28对色谱分析法而言可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R1.5） 本步骤主要考察需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验 第二十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月292. 空白生物基质试验空白生物基质 (blank biological matrix)如空白血浆按

16、“空白溶剂试验” 项下方法操作考察目标生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” 内不应出现内源性物质信号第二十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月30celecoxib塞来考昔第三十张，PPT共一百页，创作于2022年6月313. 模拟生物样品试验 模拟生物样品空白生物基质中加入待测药物，照 “空白溶剂试验” 项下方法操作考察目标：方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、药物的萃取回收率等各项技术指标 同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性第三十一张，PPT共一百页，创作于2

17、022年6月32对色谱分析法而言进一步考察待测药物、内标物与内源性物质(或其它药物)的分离情况如色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分（如何确定？） 标准曲线的截距是否显著偏离零点等均可说明内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰第三十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月334. 实际生物样品的测试 空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)实际生物样品确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试考察目标：代

18、谢产物对药物、内标物质的干扰情况进一步验证方法的可行性 ？第三十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月34空白血浆空白血浆+标准标准溶液志愿者实际样品空白溶剂试验 多余？第三十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月35第三节 分析方法验证的内容与要求 基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：1、生物样品量少2、药物或活性代谢产物浓度低3、内源性物质的干扰4、生物的个体差异较大第三十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月36（二）方法学确证建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床药代动力学研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分确证，一般应进行以下几方面的考察：

19、1、特异性(Specificity)2、标准曲线和定量范围（Calibration Curve）3、定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）4、精密度与准确度（Precision and Accuracy）5、样品稳定性(Stability)6、提取回收率7、微生物学和免疫学方法确证8、方法学质控摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 第三十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月37 用于实际生物样品分析之前： 需要验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素： 取样、样品制备、色谱分离、检测与

20、数据评价 使用的样品通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样 验证的技术指标效能指标第三十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月38验证步骤首先为分析方法的验证特异性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、稳定性等其次为生物基质中待测药物稳定性的验证室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环 Freeze-and-thaw cycle第三十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月39验证的效能指标与基本要求1特异性（专属性）避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际状况相符4精密度结果可重现5定量限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保检测的

21、灵敏度第三十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月40一、方法特异性(专属性或选择性) 方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力，通常表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有选择性包括将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力特异性函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 特异性用于考察方法的抗干扰程度。如果特异性不佳，方法的准确度、精密度、线性都将受到影响。因此确保特异性是建立和验证一个分析方法的第一步。第四十张，PPT共一百页，创作于2022年6月4

22、11. 内源性物质的干扰比较待测药物或其活性代谢产物的对照品 （或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）的检测信号如HPLC色谱峰的 tR、n 和拖尾因子（T） 是否一致，以及与内源性物质色谱峰的分离度（R）确证内源性物质对分析方法有无干扰考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月422. 代谢产物的干扰 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号如HPLC中药物色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致，或改变色谱条件(色谱柱)再比较，以及与代谢产物的R，来确证代谢产物对分析方法有无干扰。结构已知的特定活性代

23、谢物的测定通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性对于结构未知的代谢产物的测定采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况。第四十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月43 对于色谱法至少要考察6个不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（LC-MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 第四十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月443. 伍用药物的干扰TDM时 还要考虑

24、患者可能同时服用药物的干扰 通过比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况第四十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月454. 与参比方法的相关性 除上述方法外，有时还可使用参比方法对照法。参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。如在TDM中使用UV(或RIA)时, 可以HPLC(或GC)为参比 参比方法测定结果为横坐标(X); 拟定方法结果为纵坐标(Y)用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等)、相关系数(r)表示两种方法测得结果的一致性，若 r 1，表示拟定方法为

25、非线性，如 RIA 中抗血清滴度选择不当第四十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月464. 与参比方法的相关性YabX 截距(a) 表示拟定方法受到恒定干扰的程度内源性物质(UV)斜率(b) 表示拟定方法受到比例干扰的程度标记抗原不纯(RIA) 与参比方法的相关性比较，除显示分析方法的特异性外，还反映分析方法的准确度。斜率b表示两种方法测得结果的一致性若参比方法准确度良好，且截距a0, 则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%)第四十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月47二、标准曲线与线性范围标准曲线（standard curve） 校正（calibration curve）

26、or 工作 （working curve）指生物样品中所测定药物浓度与响应（峰面积或峰高）的相关性（呈比例的程度）通常用回归分析方法所得的回归方程来评价除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式常用的回归分析法为最小二乘法（least squares）或加权最小二乘法（weighted least squares）线性范围（linear rang）标准曲线的最高与最低浓度的区间在此线性范围内，模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第四十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月48二、标准曲线与线性范围(续)标准曲线用模拟生物样品建立线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物

27、样品中的药物浓度不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备第四十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月49标准曲线的一般建立过程： 标准系列溶液的制备内标溶液的制备 标准系列模拟生物样品的制备、测定标准曲线的绘制加权最小二乘法限度要求第四十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月50标准曲线的一般建立方法 1. 标准系列溶液的制备 标准物质对照品、标准品溶剂水或甲醇（或其他适当溶剂）浓度模拟生物样品中药物浓度的50倍以上加入量为生物样品总体积的2%以下避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异。难溶性药物，浓

28、度较低应除去溶剂后再加入生物基质 结晶？否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀 第五十张，PPT共一百页，创作于2022年6月51至少含58个浓度点(不包括零点，即空白)可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5设定最高浓度为100，最低浓度为1 (个体差异)第五十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月522、内标溶液的制备内标物质对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、3

29、20 g/ml，则内标的浓度应配制成40 g/ml 在这里，加内标溶液时并没有象标准溶液那样要求加入量为生物样品总体积的2%以下，为什么？第五十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月533. 标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质(如血浆)加入标准系列溶液适量，涡旋混匀 标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于Cmax的105。 目的涵盖为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失 ？先加入标准溶液 再加入空白生物基质涡旋混匀 第五十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月544. 标准曲线的绘制以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高) 或与内标物质的检测

30、响应的比值(内标法)(因变量, y )对模拟血药浓度 (自变量,x)求得回归方程( yabx )及其相关系数( )在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如：（1）样品处理有损失；（2）色谱图有问题；（3）显著偏离标准曲线其余应有至少5个浓度点在标准曲线上第五十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月555. 加权最小二乘法 普通最小二乘法每个浓度点绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性 若标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102)低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求。加权最小二乘法回归计算时增加一个权重因子(w)各浓度

31、的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小 式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子第五十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月561）回归方程(y = a + b x)参数的计算现在有专业软件第五十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月572）权重因子的选择选择加权因子时兼顾考虑曲线上高、中、低各浓度点的准确度，赋予低浓度点以更大的权重在实际工作中的一般方法（1）当wi=1/(yi)2时，则（2）而yi与xi成正比（3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 当高浓度点测量值的准确度下降过大低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi第五十七张，PPT共一百页，创作于2

32、022年6月58标准曲线的限度要求标准曲线至少包括5个浓度(通常为58个浓度,不包括零点)最高浓度应高于用药后生物体内药物的达峰浓度(Cmax)，最低浓度应为方法的LOQ(非LOD)，并应低于Cmax的105（1/10-1/20）若标准曲线浓度范围较宽，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200相关系数要求 0.99(色谱法)或0.98(生物学方法)回归方程的截距应接近于零，b1使之具有较高的灵敏度-与坐标的标度选择有关在药代动力学或生物利用度研究中：第五十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月59三、准确度 方

33、法准确度(accuracy)系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度理论上应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的。所以，通常使用模拟生物样品测定，以测得的浓度与添加的理论浓度比较计算求得。一般用相对回收率(relative recovery，RR) 或 相对误差(relative error，RE)表示第五十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月601. 测定法 取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，在标准曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3个浓度每一浓度至少5个样本与随

34、行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次 ，用标准曲线计算测得的浓度第六十张，PPT共一百页，创作于2022年6月612. 结果计算与限度要求 计算测定值M(measured)的平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值相对回收率相对误差限度要求相对回收率应在85%115% (LOQ附近80%120%)RE在15% (LOQ附近为20%)第六十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月62四、精密度 方法精密度(precision )系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度表示该分析方法的可重复性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一

35、理论上，精密度应使用实际生物样品测定。但实际上生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml)使用模拟生物样品测定，且通常与方法准确度评价同时进行，如日内精密度即可使用方法准确度的测定数据计算。第六十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月631. 表示方法方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD= =在体内药物分析中，方法精密度一般用RSD表示。第六十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月64 批内(within-run或intra-assay)RSD 系指在同

36、一分析批内测定结果之间的RSD。一个分析批通常在一个工作日内完成，又称为日内(within-day)RSD。 无论是药代动力学试验或治疗药物监测监测，通常在一个工作日内难以完成全部样品的分析。在不同工作日之间的实验条件有可能发生微小变化，对分析结果有可能产生影响。所以，方法精密度除要考察批内RSD 外，同时还有考察批间RSD。 批间(between-run或inter-assay)RSD 系指在不同分析批的测定结果之间的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日内完成，又称为日间(between-day，day-to-day)RSD。第六十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月652. 测定

37、法分别测定法()取空白生物基质(如血浆)数份，照准确度项下方法，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定批内RSD：一个工作日内完成，随行制备一条标准曲线和每一浓度56个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度的RSD批间RSD：在至少5个工作日内完成，每一工作日内完成一个分析批的测定。每一分析批内制备一条标准曲线和每一浓度1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度56个分析批数据)的RSD第六十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月662. 测定法若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的

38、每1批次为56个样本)采用多次分析的方差分析法 批间RSD =批内RSD = =批内与批间RSD第六十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月673. 限度要求在药代动力学和生物利用度研究中对g/ml级水平的RSD一般应10%ng/ml级水平的RSD一般应15%在LOQ附近RSD应20%。 第六十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月68五、定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度，又称为方法灵敏度(sensitivity)标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ)要

39、求应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或Cmax的105准确度在80%120%(或RE在20%的范围内)RSD20%第六十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月69最低检测限（limit of detection LOD）：是指可在噪音水平下识别生物样品中药物的最低浓度，一般认为信噪比（S/N）3，信号可被检测，故以S/N3时的样品浓度作为LOD。 LOQ的检测信号至少是LOD的2倍以上，以（S/N）10 作为 LOQ 的估计值。第六十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月70LOD TestS/N3第七十张，PPT共一百页，创作于2022年6月71六、稳定性 生物样品量

40、较大时，在一个工作日内难以完成全部样品的分析；有时样品需进行复测。因此生物样品及其预处理后的残渣或溶液的稳定性就显得尤为重要。需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠 方法稳定性 生物样品的稳定性稳定性第七十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月72（一）方法稳定性：首先考察待测药物的标准品（内标、衍生化试剂）或其分析溶液在实验室温度、湿度、光照及暴露空气等条件下的稳定性； 在分析方法的建立时要考虑模拟生物样品的预处理过程（提取、净化及相转移）及待测物（蒸干后的残渣及其溶液）在室温或冰箱中存放的稳定性。第七十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月73短期稳定性：

41、主要考察模拟生物样品在室温、4或20以及冻融循环条件下的稳定性（二）生物样品的稳定性长期稳定性：主要考察生物样品长期冰冻（20 或80）后的稳定性，考察期限从生物样品的采集到分析完毕的整个时间区间。第七十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月74测定方法与要求1、取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时测定的5以内（经衍生化处理15以内）。若考察时间大于1天，则应与新制QC样品比较，若考察时间很长，可与在液氮中保存的样品在相同条件下的测定值比较2、稳定性期限要求室温下存放一般仅考察1个工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中数个工作日

42、（或数星期、数月）第七十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月75七、萃取回收率（Extaction recovvvery） 从生物样品基质中回收得到分析物质的响应值与加入的标准品的响应值的百分比即为分析物的萃取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物萃取出来供分析的比例。 应考察高、中、低 3 个浓度的萃取回收率，其结果应当精密和可重现第七十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月761. 测定法取空白生物基质(如血浆)，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积

43、，同法测定AT经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法)AS未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)第七十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月77实验过程中的注意事项1、要考察是内源性物质还是提取方法对提取回收率产生影响2、测定回收率时，如采用内标法，内标应在提取之后，溶剂蒸发之前加入3、采用内标法定量时，应同时测定内标物质的提取回收率，只需配制一个中间浓度的QC样品5份，同法测定。第七十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月782. 限度要求在生物利用度或 TDM 时高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应70%高、中浓度的RSD应15%低浓度的RSD应20%内标法中内标物质的提

44、取回收率应50%（RSD 15%) 第七十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月79（1）方法准确度(或相对回收率，relative recovery) （2）萃取回收率(绝对回收率，absolute recovery) 萃取回收率与相对回收率的比较：（1）萃取回收率主要考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失（2）相对回收率主要用来考察测定方法的准确度，采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第七十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月80有时，低浓度的回收率大大低于高浓度的回收率，其原因可能是疏水性药物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。 解决办法：表面硅烷化处理或加入可降低吸附的试

45、剂如异丙醇、异戊醇、乙二胺等。第八十张，PPT共一百页，创作于2022年6月81八、质量控制1、质控样品（Quality control QC）：是指将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品，用于整个分析过程中的质量控制，一般配制高、中、低三个浓度的样品 分析方法建立并通过验证后，方可进行实际生物样品的测定，此时仍需对分析数据的质量进行监控！ 质控样品池由不负责生物样品测试的人员（推荐由独立的人员）在实验开始时制备，并与实际生物样品在相同条件下储存第八十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月822、质量控制（1）测定法：在测定过程中，每批生物样品都应建立相应的标准曲线，并随

46、行间隔以高低或低高测定高、中、低至少3个浓度的6个QC样品（2）限度要求：6个QC样品中至少4个的测定结果的准确度在各自正常浓度80120，RSD 20%，允许有2个QC样品超出各自的20第八十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月83 由于生物基质中存在内源性的该物质，难以测定方法的LOQ和准确度，此时可通过以下方法制备空白生物基质：1、对生物基质进行处理-活性炭滤过、透析2、使用不含内源性物质的生物基质周期性变化的内源性物质如某些激素。3、使用替代基质如兔血浆、人血清蛋白、缓冲液九、生物样品测定中其它情况（一）作为外源性药物使用的内源性物质的测定第八十三张，PPT共一百页，创作于202

47、2年6月84出现以下情况时，分析方法需进行再评价或交互验证：1、改变色谱条件或生物样品的处理方法样品的前处理方法改变后需要对效能指标进行重新考察2、改变生物基质 不同物种的同种生物基质（大鼠血浆 人血浆）、同一物种的不同生物基质（血浆 血清）、甚至使用相同基质而使用不同抗凝剂等。（二）方法的再评价或交互验证：第八十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月85（三）实际浓度超出标准曲线的处理：1、浓度高于定量上限取样品用空白基质稀释，同时制备高于定量上限的QC样品，同法稀释后测定，以确认稀释的有效性。2、浓度低于LOQ增加生物样品的体积，使测定液的浓度高于LOQ。应在相同条件下制备QC样品和增

48、加体积后的空白生物基质进行试验，以确认方法的准确度、精密度和特异性符合要求。第八十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月86第四节 体内药物分析方法应用示例第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究一、文献调研在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。 第八十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月87药动学参数吸收过程空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%70%Cmax 口服500mg后平均Cmax为2.42.6mg/LTmax 12hT1/2 血中T1/

49、2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h蛋白结合率20%40%代谢口服给药24h内，40%50%原形、15%代谢物经肾排出第八十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月88体内分析方法RP-HPLC色谱柱ODS色谱柱流动相甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.33.5)，或离子对色谱: 溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵)检测紫外或荧光检测生物样品预处理蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样溶剂萃取法二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂蛋白沉淀-溶剂萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取 第八十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月89二、分析方法设计1分析方法

50、血浆蛋白结合率低(20%40%)、以原形从肾排泄生物等效性研究测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法2检测方法紫外灵敏度1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求荧光灵敏度0.1ng，能满足本试验要求 第八十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月903样品制备方法初步拟定采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析预试含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致

51、检测灵敏度降低(峰高降低)经进一步试验，确定为：血浆0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取60氮气流吹干流动相200l溶解20l进样灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax2g/ml) 第九十张，PPT共一百页，创作于2022年6月91三、实验方案1给药方案 20名受试者随机分为两组，每组10人第1次试验第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂第2次试验第1次服药后第7天（有足够长的清洗期）开始，两组交换给药第九十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月922血样的采集与处理分别口服给药前和给药后0.25、0.5、

52、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57个t1/2)小时由肘正中静脉取血 4 ml立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆，-20冰箱中保存待测第九十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月933血样分析法色谱条件高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器)；色谱柱为Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m)流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min激发波长为ex=277nm，发射em=445nm柱温为40。 第九十

53、三张，PPT共一百页，创作于2022年6月943血样分析法血浆样品的预处理取血浆0.5ml，加内标溶液(10g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50 l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60下氮气流吹干，残渣加流动相200l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20l进样 第九十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月95四、分析方法验证1方法特异性环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰。志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故