肝糖原的提取、鉴定及定量实验报告

1、-. z.生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导教师评分 FORMTE*T *教师签名 FORMTE*T 李*批改日期20 FORMTE*T 13-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其考前须知。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和考前须知，掌握其操作方法。3、正确操作

2、使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。实验原理1、肝糖原的提取与鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分别离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反响和葡萄糖的复原性，可判定肝组织中糖原的存在。Cu

3、SO4十2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)22Cu(OH)2十C6H12O6=2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=Cu2O(红色)+H2OCu(OH)2=CuO(黑色)+H2O2、肝糖原定量测定 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10100)g*围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反响与同样处理的葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法直接比拟法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先臵于浓碱中加热

4、，以破坏其它成分，而保存肝糖原。三、材料与方法：以流程图示意1、材料：1样品：鸡肝2试剂：95%乙醇、5%W/V三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L50%NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L30%KOH溶液、标准葡萄糖液50mg/L、蒽酮显色剂3仪器和器材：普通离心机、室温-100恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管2ml、5ml、1000l微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反响板2、方法：1肝糖原的提取与鉴定混匀糖原水解液呈色比照+50%NaOH 5滴+浓HCL5滴沸水浴15min，冷却加碘试剂

5、2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴沸水浴2min，溶解沉淀沉淀弃去鸡肝约1g，剪碎+5%CCl3COOH 1ml研磨至乳状+5%CCl3COOH 3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3min4000r/min上清液取2ml离心5min4000r/min+2ml 95%乙醇，混匀，静置10min沉淀上清液弃去白瓷板孔穴中糖原溶液1ml糖原水解液2滴+班氏试剂4滴沸水浴2min，观察变化2肝糖原定量测定+30%KOH 1.5ml 用吸量管在分光光度计620mm波长处，用空白管溶液调零，测定并记录各管溶液的吸光度A沸水浴10min，冷却往空白管中参加蒸馏水1.0ml，标准管中参加标准葡萄糖溶液1.0m

6、l，样品管中参加糖原提取液1.0ml加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液冷却，全部转入100ml容量瓶中取鸡肝0.15g于试管中沸水浴15min取3支试管，分别标记为空白管、标准管、样品管往三支试管中分别参加0.2%蒽酮溶液2.5ml，混匀四、结果与讨论： = 1 * GB3 结果：实验数据、现象、图谱； = 2 * GB3 讨论：以结果为根底的逻辑推论，并得出结论。1、结果：1实验现象：1肝糖原的提取与鉴定第一次离心后，肝匀浆分为2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀。 图1 肝匀浆 图2 肝匀浆第一次离心后参加乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。第二次离

7、心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀。 图3 第二次离心后的白色沉淀参加蒸馏水并沸水浴后，白色沉淀溶解。白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别。 碘试剂2滴糖原溶液2滴碘试剂2滴图4 呈色比照结果左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂 往糖原水解液中参加班氏试剂后，溶液呈蓝色班氏试剂本身为蓝色。沸水浴后，溶液变为砖红色生成砖红色沉淀。砖红色沉淀 图5 糖原水解液 图6 沸水浴前 图7 沸水浴后2肝糖原定量测定往鸡肝中参加KOH并沸水浴后，溶液变为红棕色。图8 沸水浴后，溶液变为红棕色 水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色颜色比空白管浅。水浴后，

8、空白管无明显变化，标准管颜色略变深，样品管由黄色变为深绿色颜色比标准管深。空白管标准管样品管空白管标准管样品管 图9 水浴前 图10 水浴后2实验数据：测定次数标准管样品管10.5930.40120.5930.39730.5940.396平均值0.5930.398表1 标准管和样品管测得的吸光度A620及平均值按下式计算样品中肝糖原的含量：肝糖原g/100g肝组织=A样品* 0.05 *100*100* 1.11A标准肝组织重g1000由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。结果：肝糖原的含量为4.966g/100g肝组织。故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为4.966g/1

9、00g肝组织。2、讨论：1实验数据分析：本次实验测得肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝肝糖原含量为23g/100g肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原，试验所用鸡肝为脂肪肝。2呈色比照结果分析：糖原溶液与碘试剂反响呈红棕色，与碘试剂本身的黄色区别明显，说明糖原含量较大。3糖原水解液与班氏试剂反响结果分析：该反响主要是通过检测葡萄糖与班氏试剂的复原性糖反响间接鉴定溶液中糖原的存在。糖原溶液被浓盐酸水解为葡萄糖，葡萄糖中的醛基可被Cu(OH)2氧化为羧基，即把葡萄糖氧化为葡萄糖酸，Cu2+则被复原生成Cu2O砖红色沉淀。因此水浴后，溶液由蓝色变为砖红色，实验现象明显。4考前须知：1蒽酮试剂为浓硫酸所配制，使用时应小心慎重。假设不慎沾到皮肤上，应立即用大量清水冲洗。2离心后，用移液枪吸取上清液时应防止枪头触及沉淀，否则会使沉淀物上浮，导致上清液浑浊。防止将枪头伸到液面下再按按钮，否则枪头喷出的气泡也会激起沉淀物。3翻开室温-100恒温水浴箱盖子时要小心水蒸气，以免