一株伏马毒素降解菌的筛选与鉴定

1、一株伏马毒素降解菌的筛选与鉴定杨朋飞基金项目：国家重点基础研究发展计划（2013CB127805）收稿日期：2015-09-08作者简介：杨朋飞，男，1989年出生，硕士，药物化学通讯作者：孙长坡，男，1975年出生，博士，研究员，粮油微生物与质量安全,2 常晓娇2,3 伍松陵2 王峻2 王楠希2 屈凌波1 孙长坡2 （河南工业大学生物工程学院1，郑州 450001） （国家粮食局科学研究院2，北京 100037）（河南工业大学粮油食品学院3，郑州 450001） 摘 要 以伏马毒素FB1为唯一碳源，采用富集培养法从污泥样品中分离到一株高效降解FB1的菌株。经高效液相色谱（HPLC）法检测，该

2、菌在液体无机盐培养基（MSM）中对FB1有良好的削减能力，5 d内可将25 g的FB1完全降解。通过对该菌的16S rDNA序列进行同源性分析，并结合生理生化实验，最终鉴定为鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis sp.），命名为ASAG22。进一步研究表明，ASAG22细胞内产生的活性物质将FB1降解为四种质荷比分别为406.3527、288.2099、264.1827和220.1569的新物质，且该活性物质经蛋白酶K处理而失去活性。关键词 伏马毒素 鞘氨醇盒菌 生物降解伏马毒素（Fumonisins，FB）主要是串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme），多育镰刀菌（F. pro

3、liferatum），轮枝镰孢菌（F. verticillioides）和花腐镰孢菌（F. anthophilum）等镰刀菌产生的水溶性次级代谢物1。1988年，由Gelderblom从串珠镰刀菌培养液中分离出，至今共发现FB1（相对分子量721.83，化学结构式如图1）、FB2和FB3等28种伏马毒素2。其中，FB1的含量最高（约70%），污染范围最广，毒性也最强。图1 FB1的化学结构式伏马毒素主要存在于玉米、小麦、豆类等谷物和其加工制品中2。美洲、欧洲、非洲和亚洲温带地区的污染玉米中都发现了FB存在3。2011年，Biomin公司对来自世界各地的4327份饲料及饲料原料进行检测，发现FB

4、的阳性检出率为51%4。FB在国际上没有统一的限量标准，美国FDA规定的食品中最大限量为2.0 g/g5，欧盟为1.0 g/g6，而我国至今未出台FB的限量标准。联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会暂定人类对FB每日最大耐受摄入量为2 g/(kgd)7。伏马毒素的毒性对人畜危害非常大。FB会对马、猪、牛、羊、鸡和鸭等牲畜的心脏、肾脏和肝脏产生致命毒性8。流行病学调查显示人类食管癌与食用FB污染的谷物有关9。中国山东省某地区原发性肝癌发病率的提高也与FB污染有关10。国际癌症研究中心评估伏马毒素对人类的危害后，将其列为可能致癌物11。去除粮油食品中的FB，保证食品安全是当前研究的

5、热点。Generotti等12研究了在工业加工过程FB在谷物制品中的含量变化，结果显示清洗和谷物去皮可减少谷物粉中约40%的FB。Xing等13用ELISA法检测八种植物的精油对FB1的降解作用，发现肉桂油对FB1的降解率达94.08%。Heinl等14在细菌Sphingopyxis sp. MTA144中找到了水解FB1的关键基因，并且推测经过两步酶促反应将FB1脱毒。FB的结构非常稳定15，物理和化学方法不能有效去除FB，而且还会残留其它物质；生物法可将FB转化、代谢为低毒或无毒产物，是一种非常有前景的方法。2014年11月，百奥明研发的FB降解酶制剂FUMzyme成为首个得到欧盟认证的能

6、将FB通过生物转化降解为无毒代谢产物的酶制剂。有学者已经筛选到了FB降解菌，Camilo等16从玉米和青贮饲料中筛选到一株酵母菌（SE3071）和三株芽孢杆菌（S9、S10和S69），它们对FB1的降解率分别为57%、43%、48%和83%。Raffaella等15从意大利的玉米地采集了21份土壤样品中分离到一株革兰氏阴性菌NCB1492（疑似新种），将该菌在BYE液体培养基（FB1含量为0.5 mg/mL）中震荡培养，经5次转接共培养了42 d，用薄层色谱法检测发现FB1完全降解。本文采用富集培养法，以FB1为唯一碳源，从污泥中分离到一株可以完全降解FB1的菌株，为食品和饲料中的FB降解研究

7、提供良好的基础材料。1 材料与方法1.1 样品与试剂1.1.1 样品样品采集于北京、河南和云南三地的土壤、污泥和发霉的玉米，详细来源见表1。表1 样品来源样品编号样品来源样品编号样品来源A北京市温榆河边污泥H郑州大学眉湖污泥B北京市颐和园树下土壤I洛阳市孟津县发霉玉米C北京动物园树下土壤J实验室保存发霉玉米D奥林匹克森林公园树下土壤K郑州森林公园土壤E河南工业大学池塘污泥L北京东沙各庄下水道污泥F河南工业大学树下土壤M云南土壤样品G郑州大学树下土壤N云南污泥1.1.2 试剂与培养基色谱级甲醇和乙腈购于美国Thermo Fisher公司；FB1标准品购于北京泰乐祺科技有限公司；PMD 19 -

8、T Vector、DNA Marker、Premix Taq酶购于Takara公司；培养基及其它生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术公司。无机盐培养基（MSM）：MgSO47H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 0.5 g，CaCl22H2O 0.066 g，Na2HPO4 12H2O 6.15 g，KH2PO4 1.52 g，加去离子水定容至1 L，调pH至6.8；LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去离子水定容至1 L；PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24g，加去离子水定容至1 L，用盐酸调

9、pH至7.4，培养基及缓冲液均于121 灭菌20 min，固体培养基加1.3%的琼脂粉；邻苯二甲醛（OPA）衍生液：40 mg OPA溶于1 mL甲醇中，用5 mL 0.1 mol/L四硼酸钠溶液稀释，加50 L-巯基乙醇，混匀，避光保存；FB1毒素管：25 g的FB1中加500 L MSM液体培养基。1.2 仪器设备Waters e2695高效液相色谱仪、荧光检测器（2475）、Waters xbridge C18色谱柱（250 mm4.6 mm5 m）：美国Waters公司；Agilent 6510 Q-TOF LC/MS：美国Agilent公司；BIO-C1000型PCR仪、电泳槽、凝胶

10、成像仪：美国Bio-Rad公司；二级生物安全柜：美国Esco公司；恒温摇床：瑞士Infors公司；紫外可见分光光度计：美国Thermo公司；Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。1.3 试验方法1.3.1 FB1降解菌株的筛选与分离取5 g样品于30 mL无菌水中混匀，静置取上清液100 L进行梯度稀释，分别取浓度为10-6、10-7和10-8的菌悬液200 L于FB1毒素管中，在漩涡振荡器上混匀，再涂布于固体MSM平板上，置于30 培养箱中培养7 d。对长出的菌斑划线分离，于30 培养3 5 d。挑取单菌落于FB1毒素管中，30 ，220 r/min培

11、养10 d。从毒素管中取100 L待测液于液相小瓶中，再加入400 L 50%乙腈水和500 L OPA衍生液，混匀，静置1 min，HPLC检测。1.3.2 FB1的HPLC检测方法FB1的高效液相色谱检测前处理及检测条件参考GB/T25228-201017。1.3.3 ASAG22的鉴定形态鉴定：将纯化的菌株在固体LB平板划线，30培养至长出单菌落，观察菌落颜色、大小、形状、边缘、表面、隆起形状和透明度等指标。对菌株进行革兰氏染色，于显微镜下观察细菌形态并拍照。理化鉴定：在中国科学院微生物所用Biolog微生物鉴定系统对ASAG22进行了68种碳源的利用实验和23种化学物质的敏感实验。分子

12、生物学鉴定：以ASAG22的菌液为模板，细菌的通用引物16SF和16SR作为上下游引物 。PCR反应体系：模板1 L， Premix Taq 12.5 L，16SF、16SR各1 L，ddH2O 10.5 L。PCR反应程序：98 预变性5 min，94 变性1 min，54 退火45 s，72 延伸2 min，30个循环，72 延伸10 min，4 保存。对PCR产物进行胶回收，连接体系10 L：目的片段3 L，PMD19-T Vector 1 L，10T4 DNA 连接缓冲液1 L，T4 DNA 连接酶（350 U/L）1 L，ddH2O 4 L，16 连接8 h。连接产物热激转化至E.c

13、oli DH5感受态细胞中，进行蓝白斑筛选。对长出的白菌斑进行PCR鉴定和酶切鉴定，正确后送华大基因公司测序。测序结果在NCBI上使用BLAST进行序列比对。1.3.4 菌株生长和降解能力的测定菌株生长曲线绘制：设置3组平行实验，分别从平板上挑取ASAG22单菌落于100 mL液体LB培养基中，30 ，220 r/min培养。每隔4 h取样一次，并测其在波长600 nm时的吸光度。菌株降解曲线的绘制：设置3组平行实验，分别从平板上挑取ASAG22单菌落于FB1毒素管中，30 ，220 r/min培养。每隔1 d取样一次，并用HPLC检测，计算降解率。1.3.5 降解FB1活性物质的定位和性质的

14、初步分析从平板上挑取ASAG22单菌落于5 mL液体LB培养基中，30 ，220 r/min培养过夜，按1%接种量转接于100 mL液体LB培养基中，培养1 d。取培养的菌液于4 ，8000 r/min离心10 min。上清液用0.22 m水系滤膜过滤，取500 L上清滤液于FB1毒素管中，以100 灭活的滤液作对照。将收集的菌体用30 mL PBS缓冲液清洗3次，并将菌体悬浮于30 mL PBS缓冲液中。用高压细胞破碎仪，设置压强为15 Kpsi，破碎菌体。菌体破碎液于4 ，8000 r/min离心10 min，上清液用0.22 m水系滤膜过滤，取500 L上清滤液于FB1毒素管中，以100

15、 灭活的上清滤液作对照。将500 L PBS缓冲液加入FB1毒素管作为空白对照。实验组和对照组均于30 ，220 r/min培养3 d，用HPLC检测。取细胞破碎后的上清液2 mL加50 L蛋白酶K（20 mg/mL）混匀，55 温浴1 h。分别取500 L破碎上清液、蛋白酶K处理液和蛋白酶K处理灭活液加入FB1毒素管。30 ，220 r/min培养3 d，用HPLC检测。1.3.6 菌株ASAG22对FB1降解产物的初步分析从平板上挑取ASAG22单菌落于FB1毒素管中，30 ，220 r/min培养。间隔1 d取样，每次取样100 L，共取样5次，5 ppm的FB1标准品作对照。每次取样完

16、毕，立即放入真空浓缩仪，60 蒸干1 h。蒸干样品于200 L甲醇中超声复溶，16000 g离心10 min，取上清液稀释10倍待测。质谱条件参考李正翔等18的检测方法。通过每个样品特征离子提取及比对，分析ASAG22降解FB1后的产物。2 结果与分析2.1 FB1降解菌株的筛选和分离将采集的 14个样品进行富集培养，对有降解能力的菌株进行分离，从样品E中分离出一株FB1高效降解菌，命名为ASAG22。在MSM培养基中，30 ，220 r/min，培养5 d，可将25 g的FB1完全降解，完全降解后的HPLC图谱，如图2所示。FB1保留时间RT=8.198 min，对照组样品此处有强吸收峰，而

17、加入降解菌的实验组样品基本无FB1目标峰检出，表明培养液中FB1已被完全降解。图2 FB1完全降解后的HPLC图谱2.2 ASAG22的鉴定2.2.1 形态鉴定通过平板划线培养5 d后观察可发现：菌落呈黄色不透明，圆形，边缘完整，表面光滑，有隆起，易挑取（图3左）；革兰氏阴性菌，无芽孢，短杆状（图3右）。图3 菌株ASAG22的菌落特征和革兰氏染色显微镜照片2.2.2 理化鉴定ASAG22可以利用D-甘露糖、龙胆二糖、L-乳酸和D-半乳糖等32种碳源，不能利用明胶、柠檬酸、D-山梨醇和甘油等36种碳源。对四唑蓝、萘啶酸和1%NaCl等10种化学物质敏感，对氯化锂、溴酸钠和四唑紫等13种化学物质

18、不敏感。2.2.3 分子生物学鉴定将经过酶切和PCR验证得到的16S rDNA基因片段进行测序，发现其大小为1494 bp。BLAST比对结果显示：菌株ASAG22与鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis sp.）同源性高达99%。送中科院微生物所进行菌种鉴定，根据菌株的细胞形态、生理生化特性、16S rDNA序列等实验数据综合分析，鉴定该菌为鞘氨醇盒菌。2.3 菌株的生长特性和降解特性降解菌ASAG22的生长曲线与降解曲线如图4所示。在液体LB培养基中，30 ，220 r/min培养12 h进入对数生长期，20 h进入稳定期。在MSM培养基中，降解菌的生长虽缓慢，但对FB1有很好的降解效果。从

19、2 d开始降解速率明显加快，培养5 d可将培养基中的毒素(25 g)完全清除。图4 降解菌ASAG22的生长曲线与降解曲线2.4 降解FB1活性物质的定位和性质的初步分析菌株ASAG22的培养液上清和菌体破碎后的上清对FB1的降解率分别为13%和99%，而两者的灭活液没有降解效果（图5）。这表明，是菌株ASAG22的某种胞内活性物质能够降解FB1。进一步的研究显示，加入蛋白酶K的上清液和两者灭活液对FB1的降解能力明显降低（图6），这说明，菌株ASAG22胞内产生的这种活性物质经过蛋白酶K处理后失去了活性。初步推断，ASAG22对FB1的降解源于细胞内产生的活性物质，且该物质被蛋白酶K处理后失

20、去对FB1的降解能力。图5 不同上清液对FB1的降解率图6 不同处理方法对FB1的降解率2.5 菌株ASAG22对FB1降解产物的初步分析分析每个样品的总离子流图（图7，从上到下依次为对照组和15 d的TIC图谱），与FB1标准品的TIC图谱比对后发现四种丰度较高的新物质： 406.3527、288.2099、264.1827和220.1569（四种新物质对应的质荷比标注在第5 d的TIC图谱中）。其中406.3527可以初步认定为FB1脱去两分子丙三羧酸后的产物，这一结果与Heinl等14的研究结果一致，其他的新物质有待进一步确证。图7 ASAG22对FB115 d降解产物的TIC图谱3 结

21、论3.1 通过富集培养法，从污泥样品中筛选到一株鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis sp.），命名为ASAG22。在MSM培养基中培养5 d，可以将25 g的FB1完全降解。3.2 该菌细胞内产生的活性物质可以将FB1降解，且该活性物质经蛋白酶K处理而失去活性。3.3 分析时间梯度降解实验的TIC图谱，发现FB1降解产物中有四种高丰度产物，分别是406.3527、288.2099、264.1827和220.1569。参考文献Li R, Tao B, Pang M, et al. Natural occurrence of fumonisins B1 and B2 in maize from

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