微生物检验十一弧菌科

1、微生物检验十一弧菌科弧菌科一群菌体短小、弯曲成弧形或直杆状的革兰阴性细菌兼性厌氧，发酵葡萄糖，许多菌株生长需要2%3%氯化钠大多数菌株氧化酶阳性具有一端单一鞭毛、运动迅速弧菌科细菌广泛分布于自然界，以水中最为多见。其中有一些种对人类致病。弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属（Vibrio）气单胞菌属（Aeromonas）邻单胞菌属（Plesiomonas）发光杆菌属（Photobacterium）发光杆菌属主要存在于海水中，对人类不致病第一节 弧菌属弧菌属（Vibrio）共有36个种。其中有12个种与人类感染有关霍乱弧菌引起霍乱副溶血弧菌引起食物中毒弧菌属与人类感染有关的弧菌属细菌霍乱弧菌

2、O1群霍乱弧菌（V. cholerae O1 group）O139群霍乱弧菌(V. cholerae O139 group)非O1群霍乱弧菌（V. cholerae non-O1 group）副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)、霍利斯弧菌（V. hollisae）、拟态弧菌（V. minicus）、河弧菌（V. fluvialis）、创伤弧菌（V. vulnificus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、少女弧菌（V. damsela）、麦氏弧菌（V. metschnikovii）、辛辛那提弧菌(V. cincinnatiensis)、弗尼斯弧菌（V. fur

3、nissii）、卡佳丽弧菌（V. carchariae）临床意义主要引起人类腹泻，也可导致肠道外感染如伤口感染、败血症等氧化酶均阳性除麦氏弧菌外能发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂O/129敏感钠离子能刺激其生长，有些菌种在无盐条件下不能生长，称为嗜盐菌（halophilic bacteria）多数能在血平板或普通琼脂平板上生长，在血平板上可呈现、或不溶血菌落。在肠道选择性培养基上如含乳糖或肌醇的麦康凯平板，许多致病性弧菌可以生长，形成糖类不发酵的菌落一、霍乱弧菌（一）临床意义霍乱弧菌（V. cholera）是烈性肠道传染病霍乱的病原体目前有155个血清群其中O1群有古典（classical）和埃尔托(

4、El-Tor)两种生物型在自然情况下，人类是霍乱弧菌的易感者自1817年以来，已发生七次世界性的霍乱大流行，均由霍乱弧菌的O1群引起前六次为霍乱弧菌的古典生物型第七次为埃尔托生物型自1992年10月起分离到新的血清群O139，现在世界各地均有流行或散发病例报告致病机制正常情况下，胃液中的胃酸可消灭食物中的霍乱弧菌但在胃酸降低时，或摄入大量的霍乱弧菌时，霍乱弧菌可以从胃进入肠道。进入肠道的霍乱弧菌通过鞭毛运动穿过肠粘膜表面的粘液层，通过菌毛定植于肠粘膜上皮细胞表面繁殖产生由染色体介导的对热不稳定的霍乱毒素（cholera toxin, CT）而致病O1群和O139群的致病机制和过程是一样的CT(

5、cholera toxin)结构基因是ctxAB操纵子由A和B两个蛋白质亚单位组成A亚单位分子量为21 812Da，由240个氨基酸组成，在成熟过程中由蛋白水解酶切割成A1和A2两部分，以二硫键相连A1为毒素活性单位，通过B亚单位结合细胞膜上GM1受体的通道或“内吞”进入细胞内，激活腺苷酸环化酶（cAMP酶），使细胞内cAMP大量增加。快速向细胞外分泌水和电解质，使肠腔内水、钠潴留，导致呕吐和腹泻，机体陷于缺水和电解质、酸碱平衡紊乱状态。B亚单位分子量为11 677Da，由103个氨基酸组成，为5个单体组成中空的寡聚体。与肠粘膜上皮细胞膜上的神经节苷脂GM1受体结合 其他致病物质El-Tor生

6、物型能产生不耐热溶血素和血凝素不耐热溶血素具有溶血活性、细胞毒、心脏毒和致死毒性El-Tor生物型的溶血特性可发生变异血凝素能凝集鸡红细胞能被D-甘露糖抑制（二）生物学特性 1.形态 新从患者标本中分离出的细菌革兰染色阴性，弧形或逗点状在患者“米泔水”样便中，可呈头尾相接的“鱼群”样排列菌体一端有鞭毛，悬滴观察时呈“穿梭”样运动有普通菌毛和性菌毛O139群有荚膜2. 抗原成分不耐热的H抗原为共同抗原耐热的O抗原具有群特异性和型特异性，是霍乱弧菌分群和分型的基础分型根据O抗原的不同，现有155个血清群O1群、O139群引起霍乱O139血清群的抗原编码基因中出现了36kb的新基因缺少了O1群高分子

7、量的O抗原侧链与O1群抗血清无交叉反应，但可与O22血清群和O155血清群产生交叉反应，遗传学特征和毒力基因与O1群相似。O2群O138群血清群可引起人类的胃肠炎，不引起霍乱流行，称之为非O1群霍乱弧菌。以往也称不凝集弧菌或非霍乱弧菌O1群霍乱弧菌的O抗原由A、B、C三种抗原因子组成通过不同组合可形成三个型别由AB组成小川型(Ogawa)AC组成稻叶型(Inaba)ABC组成彦岛型(Hikojima)彦岛型的抗原性不稳定，各型之间可以相互转换。以小川型和稻叶型为常见流行型别3. 培养特性营养要求不高，在普通琼脂上生长良好兼性厌氧。1644均可生长，以37为适宜具耐碱性，在pH6.810.2范围

8、均可生长在pH8.29.0的碱性胨水或碱性平板上生长迅速，其他杂菌被抑制生长在pH8.5的碱性胨水中经3546h增菌后可在液体表面大量繁殖形成菌膜常用的选择性培养基硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖 (Thiosufale-citrate-salts-sucrose, TCBS)琼脂平板霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色含亚碲酸钾的选择平板有4号琼脂、庆大霉素琼脂生长并将培养基中的碲离子还原成元素碲,形成灰褐色菌落中心能在无盐培养基上生长在血琼脂平板上菌落较大, El-Tor生物型可形成溶血环在含明胶的培养基上O139群霍乱弧菌可形成不透明的浅灰色菌落，周围有一圈不透明带，此菌落涂片观察可发现荚膜

9、4生化反应 氧化酶阳性发酵蔗糖，动力阳性赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性可以在无盐培养基上生长在含有高于6%氯化钠的培养基上不能生长特 征 古典生物型 El-Tor生物型 羊红细胞溶血 D 鸡红细胞凝集 +V-P 试验 +多粘菌素B敏感试验 + 组噬菌体裂解 +组噬菌体裂解 +抵抗力可在河水、井水及海水中存活20天左右对热、干燥和光敏感；10012min即死亡怕酸耐碱，在正常胃酸中仅能生存4min对常用消毒剂敏感，0.5ppm氯15min能杀死对庆大霉素耐药（三）微生物检验1检验程序2.标本采集和运送 霍乱是烈性传染病，凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断在

10、发病早期，尽量在使用抗菌药物之前采集标本取患者“米泔水”样便，亦可采取呕吐物或尸体肠内容物，或采取肛门拭子标本应避免接触消毒液采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门拭子直接插入卡布运送培养基中送检标本装在密封，不易破碎的容器中，置室温由专人输送甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送3.标本直接检查涂片染色镜检取标本直接涂片，固定染色。油镜观察有无“鱼群”样排列的革兰阴性弧菌动力和制动试验直接取“米泔水”样便，制成悬滴(或压滴)标本后，在暗视野或相差显微镜下直接观察呈穿梭样运动的细菌。同法重新制备另一标本涂片，在悬液中加入1滴不含防腐剂的霍乱多价诊断血清(效价1：64

11、)。可见最初呈穿梭状运动的细菌停止运动并发生凝集，则为制动试验阳性。可推定为霍乱弧菌存在快速诊断通过直接荧光抗体染色和抗O1群抗原的单克隆抗体凝集试验，能够快速诊断霍乱弧菌感染霍乱毒素的测定用改良的ELISA法，将纯化的GM1包被，以俘获标本中的CT。或采用乳胶凝集测定CT，有较高的灵敏度和特异性4.分离、培养与鉴定将标本直接接种于碱性胨水，或将运送培养基的表层接种于碱性胨水中3568 h后，转种TCBS琼脂平板、4号琼脂平板或庆大霉素琼脂平板，351218h观察菌落形态在TCBS上形成黄色，4号琼脂或庆大霉素琼脂平板上呈灰褐色中心的菌落，均为可疑菌落用O1群和O139群霍乱弧菌多价和单价抗血

12、清进行凝集结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告鉴定将血清凝集确定的菌落进一步纯培养，依据全面生化反应，血清学分群及分型进行最后鉴定符合霍乱弧菌的菌株尚需区分古典生物型和El-Tor生物型对病原性弧菌的主要鉴定试验为赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶霍乱弧菌和拟态弧菌可在无盐普通肉汤和普通琼脂平板上生长，而其他弧菌则不能 用于霍乱弧菌的鉴别试验霍乱红试验霍乱弧菌有色氨酸酶和硝酸盐还原能力。霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应粘丝试验（String Test）弧菌属细菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反应O/129敏感试验 O/129（2，4Diamino6，7Diisopropylpterid

13、ine，2，4二氨基6，7二异丙基喋啶）10g及150g纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感。O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感。但已有对O/129耐药的菌株出现。用此试验作鉴定时，需特别谨慎。需结合其他试验结果如耐盐生长试验等综合考虑5.抗体检测可用于霍乱的回顾性诊断和培养不能确定的霍乱病例的辅助诊断在感染发生后的10天内，特异性的杀菌抗体和抗毒素抗体升高二、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus（一）临床意义具有嗜盐性（halophilic）存在于近海的海水、海底的沉淀物、鱼虾类和贝壳及盐渍加工的海产品中主要引起食物中毒和急性腹泻是我国沿海地区及海岛食物中毒的最常见病原菌胃

14、肠炎临床表现有：恶心、呕吐、腹痛、低热、寒战等。腹泻呈水样便，偶尔血性，恢复较快，病程23天，通常为自限性还可引起伤口感染和菌血症致病物质通过菌毛的粘附毒素耐热直接溶血素（Thermostable direct hemolysin, TDH）分子量为21 000，有2个亚单位组成，能耐受10010min不被破坏溶血毒性，TDH对人和兔红细胞的溶血性较高，对马红细胞不溶血细胞毒性，对多种培养细胞如Hela细胞、FL细胞、L细胞及鼠心肌细胞有细胞毒性心脏毒性，可导致心电图异常表现如ST-T改变、房室传导阻滞、室颤或心跳骤停及心肌损伤肠毒性，使肠粘膜的毛细血管通透性增高，向肠腔分泌亢进其结构基因td

15、h也存在于其他致病性弧菌当中耐热直接溶血素相关溶血素（Thermostable direct hemolysin related hemolysin, TRH），生物学特性与TDH相似（二）生物学特性1. 形态革兰阴性杆菌，有鞭毛（极单毛），无荚膜，无芽胞2. 抗原结构 耐热的菌体（O）抗原，具有群特征性，副溶血性弧菌的O抗原有13种鞭毛抗原，不耐热，无型特异性3培养特性 营养要求不高在无盐培养基上不能生长，最适合生长的氯化钠浓度为3.5%，超过8%不能生长最适pH为7.78.0，但pH9.5时仍能生长，最适生长温度为3037在碱性胨水中经69h增菌可形成菌膜培养特性TCBS琼脂平板: 0.5

16、2.0mm大小，蔗糖不发酵而呈蓝绿色菌落普通血平板: 不溶血或只产生溶血从腹泻患者中分离到的菌株95%以上在我妻（wagatsuma）琼脂上产生溶血现象，称为神奈川现象（Kanagawa phenomenon, KP）嗜盐性选择平板: 较大，圆形，隆起，稍浑浊，半透明或不透 明，无粘性SS平板: 扁平，无色半透明，蜡滴状菌落，有辛辣味，不易 刮下，48h后牢固粘着培养基上，部分菌株不能生长麦康凯平板: 部分菌株不生长伊红美兰琼脂和中国兰琼脂培养基不能用于本菌的初次分离抵抗力抵抗力弱不耐热，90 1min即被杀死淡水中不超过2日，但海水中能存活47天以上耐碱怕酸，1%醋酸或50%食醋中1min死

17、亡 （三）微生物检验1. 检验程序 微生物检验 2. 标本采集: 可采集患者的粪便，肛门拭子和可疑食物。应及时接种，或置碱性胨水或卡-布运送培养基中送检3.分离培养与鉴定 (1)增菌培养标本接种1%NaCl碱性胨水或4%NaCl蛋白胨水 中进行选择性增菌 (2)分离培养标本直接接种或增菌后接种TCBS平板或嗜盐菌 选择平板TCBS平板：绿色或蓝绿色菌落，不透明，直径 12mm微突起菌落嗜盐菌选择性平板：较大、圆形、隆起，稍混 浊、半透明或不透明、无粘性菌落（3）鉴定氧化酶阳性，O/129（150g）敏感发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸，不发酵蔗糖、乳糖。吲哚试验阳性大部分菌株脲酶阴性，V-P阴性

18、NaCl生长试验在不含NaCl和含10%的蛋白胨水中不生长，在3%和7%NaCl 蛋白胨水中生长赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性神奈川现象阳性毒素测定用免疫学方法测定TDH和TRH。用基因探针和PCR方法直接测定毒素基因tdh或trh三、其他弧菌 除霍乱弧菌和副溶血弧菌外，以下弧菌也对人类致病。1.拟态弧菌（V.minicus） 过去认为是蔗糖不发酵的霍乱弧菌与非O1群霍乱弧菌相似与几种非O1群霍乱弧菌O抗原有交叉反应常引起胃肠炎，偶尔可见伤口感染或菌血症少数菌株可产生CT、TDH等毒素。但不引起暴发流行2.创伤弧菌（V.vulnificus）1976年首次被认识。在致病性弧

19、菌中，该菌引起的疾病最为严重，引起的菌血症和伤口感染的病程进展非常快而致命。发酵水杨酸和ONPG阳性感染通常发生在气温较高季节，通过生食牡蛎等海产品，侵入肠粘膜淋巴结和门静脉，侵入血流导致菌血症，死亡率50%青年人好发，特别是酒精性肝功能损伤或免疫缺陷人，与转铁蛋白有关引起创口感染，导致蜂窝织炎，偶尔可侵入血流导致菌血症而死亡。致病机理尚不明确，但产生的胶原酶、蛋白酶和细胞毒素可造成组织严重损害3.溶藻弧菌（V.alginolyticus）最常见于外耳、中耳感染患者，也常见 于伤口感染是弧菌属细菌中耐盐性最强的致病菌4.河弧菌（V.fluvialis） 最早从腹泻患者中分离到，全世界均有引起腹

20、泻的报道1981年被命名，之前被归类为F群霍乱弧菌 或CDC EF6群5.弗尼斯弧菌（V.furnissii）该菌很少从粪便中分离到，致病性？最近报告从腹泻患者中分离到，提示有一定临床意义6.霍利斯弧菌（V.hollisae） 可引起腹泻、创口感染及菌血症通过食用海产品和接触海水而感染通常所有的霍利斯弧菌均携带TDH基因7.其他弧菌麦氏弧菌（V.metschnikovii）氧化酶阴性，引起个别患者菌血症和霍乱样肠炎可从海产品、鸟类、河水以及污水中分离到只需微量的钠盐即可生长辛辛那提弧菌（V.cincinnatinesis）有引起菌血症和脑膜炎的报告卡佳丽弧菌（V.carchariae）有引起伤

21、口感染的报告临床意义临床标本中分离的病原性弧菌都应认为有临床意义特别是从粪便标本中分离到霍乱弧菌O1群、O139群和副溶血性弧菌从任何临床标本分离到创伤弧菌，均应通知临床医师，并根据我国传染病防治法有关规定及时作传染病报告，并将报告和菌种一起报送到各级法定部门。返回气单胞菌属和邻单胞菌属氧化酶阳性，端鞭毛、革兰阴性杆菌、兼性厌氧根据表型特征，伯杰系统细菌学手册（第一版）将 其归为弧菌科。根据基因特征，MacDonell和Colwell建议设立气单胞菌科，而邻单胞菌与肠杆菌科中的变形杆菌属有 更密切的关系。一、气单胞菌属（一）分类与命名气单胞菌属原有四个种：亲水气单胞菌（A.hydropila）

22、豚鼠气单胞菌（A.caviac）温和气单胞菌（A.sobria）杀鲑气单胞菌（A.salnonicida）杀鲑亚种（A.salnonicida subsp.salnomicida）不产色亚种（A.salnonicida subsp.achroniogenes）杀日本鲑亚种（A.salnomicida subsp.masoucida）分类与命名根据DNA杂交结果分14个基因种或DNA杂交群(DNA hybridiyation groups, HGs)，有几个新种名被提出，但很多DNA杂交群尚未命名杀鲑气单胞菌为嗜冷菌，存在于海水中引起鱼类等感染，不引起人类感染。临床意义引起肠道内感染常见5岁以下

23、儿童和成人，夏季腹泻的第二、三位病原菌临床症状从温和腹泻到严重痢疾样腹泻，成人呈慢性化主要致病物质为溶血毒素和细胞毒素等肠道外感染主要皮肤和软组织感染，主要由亲水气单胞菌和维隆气单 胞菌引起90%以上菌血症由亲水气单胞菌和维隆气单胞菌引起，通 常发生在免疫低下人群引起眼部感染、脑膜炎、肺炎、胸膜炎、骨髓炎、关节炎、腹膜炎、胆囊炎、下腔性静脉炎和尿道感染生物学特征形态革兰阴性直杆菌，有时呈球杆状；除杀鲑气单胞菌外均有动力培养特性 营养要求不高，普通培养基上可生长TCBS培养基不生长，在045范围内均可生长根据生长温度不同可分为嗜冷菌群(psychrophilic group) 35以下生长，37不生长嗜中温菌群（mesophilic group）1042之间生长生化特性 氧化酶和触酶阳性，发酵葡萄糖和其他碳水