抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法

1、 抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化复原法）1、试剂的配制1）005mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）:母液：02mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO412H2O（分子量35814）717g；母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量15601）312g。分别用蒸馏水定容到1000ml。005mol/LPBS（pH78）的配制：分别取A母液（Na2HP04）22875ml,B母液（NaH2PO4）21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。参照文件：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术高等教

2、育第一版社，2000：267268。2）145mM甲硫氨酸溶液：取21637gMet用磷酸缓冲液（pH78）定容至1000ml。（3）30uMEDTA-Na溶液：取0.001gEDTA-Na用磷酸缓冲液定容至100ml。22（4）60uM核黄素溶液：取00023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保留。5）225mM氮蓝四唑（NBT）溶液：取01840gNBT用PBS定容至100ml,避光保留。酶液制备：取02g（可视状况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH78）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g下离心

3、20min,上清液即为酶液。2、酶活性测定1）反响混淆液配制（以60个样为准）：分别取Met溶液162ml,EDTA-Na溶液06ml,2磷酸缓冲液5.4ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混淆后摇匀；（2）分别取3ml反响混淆液和30ul酶液于试管中光照下反响（3）将试管置于光照培育箱中在4000lux同时做两支比较管，此20min；中后测定作为最大光复原管，1支试管取3ml反响混淆液加入30u1PBS（不加酶液）照光1支只加缓冲液置于暗中测准时用于调零。（4）以不照光的比较管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光0D560（出现颜色即测可测定）。抗氧化酶SOD、ODCA活性测定方法 酶

4、活性计算：SOD活性单位以克制NBT光化复原50%所需酶量(测的样品值要在最大管的一半左右才适合，不然要调整酶量)为1个酶活单位(u)。SOD总活性=(Ack-AE)XV/(1/2AckXWXVt)SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/gFW)；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A为照光比较管的吸光度；A为样品管的吸光度；V为样品液整体积(ml,16ml,加入PBS的体积)；Vt为测准ckE时的酶液用量(ml,30ul)；W为样品鲜重(g,测准时应换算为叶绿体的质量mg)；蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧

5、化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液(pH60)：分别取A母液(Na2HP04)123ml和B母液(NaH2P04)877ml混匀即为1000mlPBS(0.2M,pH6.0)；反响混淆液配制(以60个样为准)：取200mlPBS(02M,pH60),加入0076ml液体(原液)愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30%的H0,混匀后保留于冰箱中备用。22样品测定：要保证每个样品从加好样到开取3ml反响液并加入30ul酶液，以PBS为比较调零，尔后测定OD470值(测定40秒)。边加样边测定,测定前等候5秒,动作要快,假如慢的话,

6、始记时的时间相差不大)(4)酶活性计算：以每minOD值变化(高升)001为1个酶活性单位(u)。POD=(A470XVt)/(WXVsX001Xt)(u/gmin)A470：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提取酶液整体积(ml,(16ml)；Vs为测准时取用酶液体积(ml,30ul)。2、过氧化氢酶(CAT)活性测定1)试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)：取A母液(Na2HP04)4575ml和B母液(NaH2P04)2925ml混淆后用蒸馏水定容至1000ml。(2)反响液配制：取200mlPBS(015M,pH7.0)，加入0

7、3092ml30%的H0(原液)摇匀22即可。测定(3)样品测定：取3ml反响液加入0.1ml(可视状况调整)酶液，PBS为比较调零，0D240(紫外)(测定40s)。(4)酶活性计算：以每min0D值减少0.011个酶活性单位u)为(CAT=A240XVtX(u/gmin)(/WXVsX0.01t)A240：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；为反响时(min)；为提t间Vt取酶液整体积ml，1.6ml)；Vs为测准时取用酶液体积(ml,0.1ml)。四、超氧阴离子自由基(02.-)产生速率的测定(羟胺氧化法)21、试剂的配制(1)1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用

8、蒸馏水定容至300ml；(2)17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少许冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=1：3配制)加热溶解后定容至400ml；(3)7mMa-萘胺溶液：称取0.4008ga-萘胺用冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=3：1配制)定容至400ml。2、02.-含量的测定2(1)样品液提取方法同SOD测定；(2)取05ml提取液(酶液)(可视状况调整用量)中加入05mlPBS(005M,pH7.8),1ml1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。3)在25C下保温1小时；抗氧化酶SOD、ODCA活性测定方法9 #4）挨次先加入1ml17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml7mMa-萘胺，混淆后迅

9、速摇匀；5）在25C下保温20min后在3000Xg下离心3min后立刻进行测定（或置于冰箱待测）6）以比较管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；依据羟胺与02.-2（7）0-含量的计算：由测得的0D530,查N0-标准曲线获得N0-；222抗氧化酶SOD、ODCA活性测定方法抗氧化酶SOD、ODCA活性测定方法 .-的反响式：NH20H+202-+N02-+H202+H20计算02.-,即NO2X2=O再H依据样品与羟胺反响的时间和样品中的蛋白质含量，求得0-产生速率(以nmolmirnmg-i2蛋白表示，也能够nmolmin-ig-i鲜重表示)。1-10产生速率=(C

10、XV)/(tXW)(nmolming鲜重)2(umol/L)；V为测准时所取提取液用量(叶绿体稀释后的C为标准曲线上查得的浓度体积);t为反响时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实质质量g)参照文件：信，罗广华植物生理学通1990,(6)：5557五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g三氯乙酸-IL0.67%TBA：335g硫代巴比妥-500ml10%TCA(避光)酸2、测定步骤开水0.2样品+16ml10%TCA研磨f12000g离10min-上1.5ml+1.50.67%TBA清煮30min-冷却，离心上清0D450,0D532,0D6003、计算组织中MDA含量:M

11、DA浓度C(umol/L)=645(0D5320D600)0.560D450MDA含量(umol/gFW)二CXV/W式中V为提取液体积(1.6ml),W为样品鲜重(02g)六、植物细胞质膜透性的测定(电导仪法)1)取新鲜叶片或根系(不可以萎蔫)0.3g，用自来水冲刷表面污渍，再用去离子水冲刷几遍后用吸水纸吸干水分；(2)样品剪碎(也可打孔取样)放入试管(或15ml大离心管)中，加10ml去离子水，在室温下搁置3h使叶片充足吸水后测定溶液电导率(R1)；3)再放入恒温水浴锅中在100C开水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；4）用公式计算质膜相对透性（用相

12、对电导率表示）：相对电导率（）=R1/R2X100%还能够计算植株损害程度：100%损害率二（办理电导率一比较电导率）/（煮沸电导率一比较电导率）X七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100mg考马斯亮蓝，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在留宿后过滤并贮于棕色瓶中，常温可在暗中保留一个月。（2）100ug/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mgBSA加水溶解后定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml再从中汲取40ml用蒸馏水定容至即为标准BSA溶液）。2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：取磷酸缓冲液（即稀释成响2min后测OD595（以100口缓冲液加100ml，100u