蛋白质和蛋白质药物2

1、蛋白质和蛋白质药物2核糖核酸酶Anfinsen经典实验变性复性一. 蛋白质一级构造与功能的关系 1. 一级构造不同，生物学功能不同 一级构造指氨基酸种类数量以及排列顺序，一级构造的差异可表现为生物学活性的不同，如p64，加压素与催产素。都是9个氨基酸，但只有3位和8位两个氨基酸不同： 加压素：Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly 催产素：Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly 加压素能促进血管收缩，升高血压，促进肾小管 对水的重吸收，表现为抗利尿的功能。 催产素能刺激子宫平滑肌收缩，表现为催产的功能。2. 一级构造中关键局部一样

2、，其功能也一样 如促肾上腺皮质激素ACTH是39肽激素，其1-24位氨基酸是活性所必须的关键局部，切去其后的25-39位氨基酸后的片断仍具有全部活性。不同动物来源的ACTH，表现出一样的生化功能，其氨基酸顺序差异主要在25-33位种族差异。 31-AA 33-AA人 Ser Glu猪 Leu Glu牛 Ser Gln 启示：化学合成ACTH时，只需要合成其活性所必须的关键部位。3、一级构造关键局部的变化，其生物学活性也改变。 实验说明，多肽链中重要的氨基酸变化，其生物学活性也发生改变。 有些关键氨基酸变化可使活性增加，如脑啡肽；而有些关键氨基酸变化可使活性大大降低，如促黄体生成释放素。4、一级

3、构造的变化与疾病的关系最常见，最经典的例子使1949年美国科学家L.Pauling提出的镰状细胞贫血症sickle cell anemia，在美国黑人中流行的一种致命的血液疾病Hbs 。 Hb是由两种异型亚基与构成的四聚体 22 正常人Hb为22与辅基共同构成，红细胞RBC呈盘状。而Hbs仅仅是因为链中6位的Glu突变为Val而导致RBC呈镰刀状，产生溶血性贫血症。镰刀状红细胞性贫血镰刀状红细胞性贫血:亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异，GluVal,这种变异来源于基因上遗传信息的突变。正常 DNA TGT GGG CTT CTT TTT mRNA ACA CCC GAA GAA AAA H

4、bA N端 苏 脯 谷 谷 赖异常 DNA TGT GGG CAT CTT TTT mRNA ACA CCC GUA GAA AAA Hbs 苏 脯 缬 谷 赖 分子病Pauling：蛋白质分子发生变异所导致的疾病镰刀型红细胞贫血二、蛋白质空间构造与功能的关系 肌红蛋白myoglobin,Mb 血红蛋白hemoglubin , Hb蛋白质的空间构造与功能关系 蛋白质生物学活性生物学功能与其空间构造密切相关，空间构造的变化往往会影响其生物学功能，表现在两个方面： 1、蛋白质变性，生物学活性丧失后边重点内容。 2、蛋白质前体活化以及酶原的激活酶的化学中讲述。1、蛋白质前体的活化 许多蛋白质前体并无

5、活性或活性很低。在一定条件下，才能转变为有特定构象的蛋白质而表现其活性。 如胰岛素前体胰岛素原，经水解酶切，除去局部氨基酸C肽，31个氨基酸并在A链21个氨基酸和B链30个氨基酸两条肽链之间形成两对二硫键，在A肽链上形成另一对链内二硫键，使胰岛素分子具有特定的空间构造，从而表现其完整的生物活性。详见下页的两张图：2、蛋白质的变构现象 一些蛋白质由于受到某些因素的影响，其一级构造不变而空间构象发生一定的变化，导致其生物学功能的改变，称蛋白质的变构现象或别构现象allosteric effect。 变构现象是蛋白质表现其生物学功能的一种普遍而又重要的现象，也是调节蛋白质生物学功能极有效的方法。 举

6、例如下：Hb通过其变构作用来到达其结合氧和释放氧的能力。血红蛋白的变构效应 Hb的主要功能之一是体内氧的运输。它与氧气的结合的饱和度随着氧分压的升高而增加，但不是直线关系，而是呈S型曲线。 意义：曲线上部比较平坦，pO2由100mmHg降至80mmHg时，pO2下降少，所以，当血液经pO2高的肺时，即使pO2有相当大改变，也不影响肺部Hb与氧气结合功能。但S型曲线中段坡度较大，意味着组织中pO2稍微有下降就可引起HbO2的解离明显增加，保证组织的氧供给。 Hb的氧饱和曲线三蛋白质构造与生物进化 从p62表3-8可见与人类亲缘关系越近，其氨基酸差异越小，如黑猩猩，与人类氨基酸的差异为零，而酵母那

7、么与人类氨基酸差异为44。这也从另一方面提醒，当一种药推向临床时，选用的临床前药理实验动物与人类亲缘性越近越好。 物种间越接近，一级构造越相似，空间构造和功能也相似。 蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其理化性质一、蛋白质的理化性质 第五节 蛋白质的理化性质及其别离纯化一局部与氨基酸相似，如两性电离、等电点、呈色反响等。也有一局部又不同于氨基酸，如高分子量、胶体性质、变性等。蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的等电点pI蛋白质的性质一、蛋白质的两性解离和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在电场中，如果蛋白质分子所带正电荷多于负电

8、荷，净电荷为正，那么向负电极移动，反之，净电荷为负，向正极移动，这种泳动现象称电泳。蛋白质在等电点PH条件下，不发生电泳现象，利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进展别离纯化。二、蛋白质的胶体性质这是蛋白质特有的性质。由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去蛋白质的胶体性质 蛋白质分子量颇大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已到达胶粒1100nm范围之内。因此蛋白质溶液具有胶体溶液的性质。 蛋白质溶液在一定条件下相当稳定，稳定该亲水胶体的因素是：

9、水化膜、电荷。+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质三、蛋白质的沉淀作用蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。(三) 蛋白质的沉淀和变性1、蛋白质的沉淀水化膜沉淀蛋白质的方法(1)盐析:参加电解质，使蛋白质发生沉淀的现象.实质：破坏蛋白质分子的水化膜和中和其所带的电荷。盐析浓度:盐析时所需电解质的最小浓度.常用盐析电解质: (NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl分段盐析:利用不同蛋白质盐析浓度不同分别离蛋白质的方法特点：盐析法沉淀的蛋白质没有变性，

10、去盐后活性恢复。沉淀蛋白质的方法(2)有机溶剂沉淀:参加极性有机溶剂，使蛋白质发生沉淀的现象.实质：破坏蛋白质水化膜。特点：低浓度、低温、短时间蛋白质不变质.(3)重金属盐沉淀: pHpI时沉淀蛋白质的方法(4)生物碱试剂沉淀: pHpI时(5)蛋白质互相沉淀:抗体 抗原反响1、可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀别离。在沉淀过程中，构造和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是别离和纯化蛋白质的根本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2、不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶

11、体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的构造和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的构造和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。四、蛋白质的变性天然蛋白质因受物理或化学因素的影响，分子构象发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学功能随之发生变化，但一级构造未遭破坏，这种现象称为变性作用。变性后的蛋白质称为变性蛋白。导致蛋白质变性的因素：热、紫外光、剧烈的搅拌以及强酸和强碱等。类型：不可逆变性、可逆变性可复性蛋白质的变性 天然蛋白质在某些物理、化学因素的作用下，丧失其生物活性，改变其理化性质的现象。物理因素：

12、加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波化学因素：强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等实质：破坏副键，改变其构象 变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、剧烈的搅拌以及强酸和强碱等。表现：物理性质：旋光度改变、粘度和外表张力增大，溶 解度降低，失去结晶性化学性质：易被水解，易发生化学反响。 如天然乳球蛋白能与12个2,4-二硝基氟苯 反响，变性后可以增至31个。生物活性：变性蛋白质可以局部或全部失去生物活性。蛋白质的变性作用变性条件： 物理因素：枯燥、加热、高压、

13、振荡或搅拌、紫外线、X射线、超声等等。化学因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、生物碱试剂三氯乙酸、乙醇等等。变性后的特点： 丧失生物活性 溶解度降低 易被水解对水解酶的抵抗力减弱。变性作用的利用： 消毒、杀菌、点豆腐等； 排毒重金属盐中毒的急救； 肿瘤的治疗放疗杀死癌细胞；变性作用的防治： 种子的贮存； 人体衰老缓慢变性； 防止紫外光灼伤皮肤。 4蛋白质的颜色反响 1缩二脲反响 蛋白质与新配置的碱性硫酸铜溶液反响，呈紫色，称为缩二脲反响。 2蛋白黄反响 蛋白质中含有苯环的氨基酸，遇浓硝酸发生硝化反响而生成黄色硝基化合物的反响称为蛋白黄反响。 3米勒反响 蛋白质中酪氨酸的酚基遇到硝酸汞的硝酸溶液。

14、 4茚三酮反响 蛋白质与稀的茚三酮溶液共热，即呈现蓝色。大局部蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进展定性鉴定。1.双缩脲反响： 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反响肽键的反响，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度 酪氨酸的显色反响酚羟基反响米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，参加米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色在蛋白质溶液中参加HCOCOO

15、H，将浓硫酸沿管壁缓慢参加，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反响吲哚环的反响鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸精氨酸的反响胍基的反响精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠或次溴酸钠溶液中发生反响，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸酪氨酸、色氨酸的反响复原反响福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反响蛋白质-铜络合物，将福林试剂复原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍灵敏度差浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反响生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发本身为红色，与蛋白质反响呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高11000微克/毫升盐析s

16、alt precipitation：中性盐硫酸铵等，分段盐析有机试剂沉淀：乙醇、丙酮，低温 免疫沉淀：抗原-抗体电泳electrophoresis：pI，分子量的大小 透析dialysis： 半透膜层析chromatography：离子交换层析、亲和层析、凝胶柱层析离心、超速离心ultracentrifugation：沉降系数S蛋白质的分离和纯化电泳electrophoresis双向凝胶电泳技术透析技术生命在于运动层析chromatography 凝胶柱层析 离子交换层析 亲和层析超速离心掌握蛋白质的元素组成、根本组成单位，氨基酸成肽的连接方式；熟悉氨基酸的通式与构造特点；氨基酸三字母英文缩写

17、。GSH由哪三个氨基酸残基组成？有何生理功能？蛋白质14级构造的定义及维系这些构造稳定的作用键？蛋白质二级构造的根本形式？并试述-螺旋的构造特点。何谓蛋白质的变性？蛋白质变性后理化性质有何改变？蛋白质变性在医学上的应用。蛋白质在溶液中稳定的因素、盐析、等电点及定量方法举例说明蛋白质一级构造与功能的关系。蛋白质的呈色反响。复习要点异硫氰酸苯酯第六节 蛋白质的别离 一蛋白质的提取 蛋白质提取的步骤： 1、材料选择 2、细胞粉碎 3、提取二蛋白质的别离纯化 一根据溶解度不同的别离纯化方法 二根据分子大小不同的别离纯化方法 三根据电离性质不同的别离纯化方法 四根据配基特异性的别离纯化方法一根据溶解度不

18、同的别离纯化方法1、等电点沉淀法 蛋白质在等电点时溶解度最小，容易发生沉淀，但沉淀不完全。在等电点处再加盐，沉淀完全。2、盐析沉淀法 中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著影响，且盐析沉淀的蛋白质一般保持天然构象而不变性制备具有生物学活性的蛋白质如酶，激素等。3、低温有机溶剂沉淀法： 有机溶剂破坏水化膜使蛋白质沉淀，如用冷乙醇从血清中别离制备人体蛋白和球蛋白。4、温度对蛋白质溶解度的影响 温度提高，虽然蛋白质溶解度增加但是容易变性所以低温操作。二根据分子大小不同的别离纯化方法 1、透析和超滤法： 透析利用蛋白质大分子不可透过半透膜的性质胶体性质。常用于蛋白质脱盐，但是需要的时间长。 超滤法ultra

19、filtration利用超滤膜在一定压力或离心力作用下，大分子物质被截留而小分子物质那么被滤出。常用于蛋白质浓缩，脱盐。方便快速，大容量。2、分子排阻层析：molecular-exclusion chromatography 利用分子筛性质来别离蛋白质，常用的凝胶有a葡聚糖凝胶；b聚丙烯酰胺凝胶；c琼脂糖凝胶。3、密度梯度离心density gradient centrifugation 三根据电离性质不同的别离纯化方法1、电泳法：带电荷的蛋白质分子在电泳场中根据其电荷量和形状不同而被别离别离的蛋白量少。如PAGE电泳，上样量少2、离子交换层析：利用蛋白质的两性解离性质，使其结合在离子交换剂上

20、，最后再将结合的目标蛋白洗脱下来，用于大量制备浓缩。但有的树脂较贵，如DEAE，100g/400-600元四根据配基特异性的别离纯化方法 亲和层析affinity chromatography：又称选择层析，功能层析等。蛋白质与其相对应的化合物称为配基具有特异结合的能力，即亲和力。这种亲和力具有以下重要特性：a、高度特异性；b、可逆性三蛋白质的纯度鉴定和含量测定 一、蛋白质纯度的鉴定 1、层析法“层析纯 2、电泳法“电泳纯 如SDS 3、免疫化学法“免疫纯二、蛋白质的含量测定1、凯氏定氮法Kjedahl法： 测定根底是蛋白质含N量均大约为16%。 蛋白质样品经浓硫酸消化，其中的氨转变为硫酸铵，经强碱碱化放出氨，通过水蒸汽蒸馏法蒸出并以硼酸液吸收。最后用标准硫酸溶液滴定，测出释放的氨含量，并计算样品中的氮素含量，再乘以6.25即为样品中蛋白质含量。 凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，也是药典规定的方法。2、福林-酚试剂法Lowry法 原理：蛋白质与福林-酚试剂呈色反响实质上是蛋白质分子中含酚基的Tyr与试剂的显色反响。 应用最广泛，灵敏度在ng级。3、双缩脲法： 碱性环境下，铜离子与双缩脲