阿霉素联合他巴唑诱导慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型的建立与

1、阿霉素联合他巴唑诱导慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型的建立与评价及真武汤干预作用的研究收稿日期：2021-07-04修回日期：2021-10-07国家科技部重点研发计划资助项目（2018YFC1704300）：“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：王拥军；国家科技部重点研发计划资助项目子课题（2018YFC1704304）：慢性肾脏病“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：赵宗江。通讯作者：赵宗江，教授，博士生导师，博士后合作导师，主要研究方向：中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究。*吴英杰 ，张新雪 ，郑鹏飞 ，张萌萌 ，杨涛 ，焦婷婷 ，赵宗江*基金项目 * 国家科技部重点研发计划资助项目 (2

2、018YFC1704300)：“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：王拥军；国家科技部重点研发计划资助项目子课题（2018YFC1704304）：慢性肾脏病“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：赵宗江。第一作者 吴英杰，在读硕士，从事中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究，E-mail： HYPERLINK mailto:1023404572 1023404572通信作者*赵宗江，教授, 博士生导师,博士后合作导师，从事中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究，TelE-mail：zongjiangz （北京中医药大学 中医学院 北京 102488）摘要 ：目的： 探讨阿

3、霉素联合他巴唑诱导慢性肾脏病肾阳虚证大鼠模型的建立方法与评价及真武汤干预作用的研究。方法： SPF级体质量200g-220 g的SD雄性大鼠52只，适应性喂养2周，随机分为正常组10只、模型组42只，模型组大鼠第3周、第4周分别按照3 mgkg-1、4mgkg-1体重尾静脉注射阿霉素进行慢性肾脏病大鼠模型造模。模型成功大鼠按体质量与尿蛋白进行分层随机，分为阿霉素组14只、他巴唑组14只、真武汤组14只，第13周起真武汤组按照5.39 g/(kg/d)-1天进行干预。观察大鼠一般情况，每周称取大鼠体质量，每4周检测大鼠24 h尿蛋白定量、采用红外测温枪检测大鼠体温，采用大鼠游泳实验检测游泳时间。

4、24周后股动脉取血并处死大鼠，称取大鼠肾脏、脾脏、睾丸重量并计算脏器指数，采用HE染色、Masson染色，观察各组大鼠肾组织病理情况。采用比色法检测血清Scr、BUN、UA、TC、TG、TP、ALB、SOD的水平；采用酶联免疫吸附法检测血清T3、T4、TSH、FSH、LH、T、E2、CORT的水平。结果： 与正常组比较，他巴唑组大鼠出现毛发枯槁、弓背、懒动、蜷缩、喜扎堆、肛周污秽、体型较为瘦弱、行动迟缓等典型肾阳虚体征，真武汤组较他巴唑组一般情况有所好转，肾阳虚体征减轻，体重显著升高（P0.01），肾脏指数、24h尿蛋白明显下降（P0.01），体温、游泳时间增加；肾脏组织HE、Masson染色

5、结果显示，阿霉素组、他巴唑组肾小球系膜区增宽，系膜细胞增生，系膜区有大量胶原纤维沉积，肾小管扩张或萎缩，存在蛋白管型，肾间质有大量炎性细胞浸润，阿霉素组球囊壁粘连明显，真武汤组病理变化有所改善；血清指标显示，与他巴唑组相比，真武汤组Scr、UA、BUN、TC、TG有降低趋势，ALB含量升高（P0.05）；甲状腺轴指标T3有升高趋势，T4显著升高（P0.01），TSH显著降低（P0.01）；真武汤组性腺轴指标FSH、LH、E2显著升高（P0.01），T无差异；肾上腺轴指标CORT各组之间无统计学差异；真武汤组SOD显著升高（P0.01）；。结论： 阿霉素联合他巴唑可以成功建立慢性肾脏病肾阳虚证动

6、物模型，真武汤干预作用也证明了该病证结合模型的成功建立，该模型主要模拟了慢性肾脏病下丘脑-垂体-甲状腺轴功能低下的肾阳虚证动物模型。关键词 ：病证结合； 慢性肾脏病； 肾阳虚证； 阿霉素； 他巴唑； 真武汤中图分类号：R285.5慢性肾脏病(（Chronic Kidney Disease, CKD)）是一种起病隐匿的临床综合征，以肾功能异常、水肿、蛋白尿、血尿、高血压等临床表现为基本特征，其发病隐匿、知晓率低、病情迁延、预后较差，严重威胁着人们的健康。有研究显示，我国成年人群中慢性肾脏病的患病率为10.8%，约1.2亿1。中医认为其属“虚劳、血尿、腰痛、水肿、关格”等疾病范畴，病位主要涉及脏腑

7、有肾、肝、脾、肺、心等, 其中与肾、肺、脾关系最为密切2。肾阳为一身之元阳，起到温煦、推动的作用，肾阳亏虚，气化无权，肾关开阖不利，水液代谢失常，聚湿生痰，日久成瘀，则见水肿、关格、血尿。吴氏3等纳入420例CKD各期患者进行慢性肾脏病与中医证型的关系探讨，结果发现CKD各期中医正虚证分布中，脾肾阳虚证占有较大比重。可见临床中以肾阳虚衰为主要证候表现的肾阳虚证在CKD中医证候研究中占有重要地位，临床上肾阳虚证为慢性肾脏病的重要证型。病证结合模式是中西医结合的重要成果，病证结合的临床研究是中西医结合研究的重要模式4-5，要求基础研究也应紧跟历史发展步伐，适应医学发展需要，病证结合动物模型的建立与

8、评价为病证结合研究的提供保障。慢性肾脏病肾阳虚证病证结合动物模型的建立为慢性肾脏病肾阳虚证的进一步研究奠定了重要基础。在现代肾阳虚的本质研究中，被证实肾阳虚证存在下丘脑垂体肾上腺轴、下丘脑垂体甲状腺轴、下丘脑垂体性腺轴不同程度、不同层次的功能紊乱6，他巴唑为甲状腺抑制剂，可以影响甲状腺激素的合成，导致甲状腺功能减退，从病理角度模拟甲状腺功能减退的肾阳虚模型。真武汤为温阳化气利水名方，是历代医家治疗由肾阳虚衰而导致阴水的代表方剂，临床上其在慢性肾脏病治疗方面取得较好的疗效7。本研究首次通过分次尾静脉注射阿霉素联合他巴唑灌胃构建慢性肾脏病肾阳虚证动物模型，以动物体征、大鼠体温、游泳体力耗竭情况、血

9、清学相关指标、肾脏病理变化，结合真武汤干预作用，从症状、客观指标和药物反证方面综合评价慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的构建成功与否。研究方案流程图见附图。1 材料1.1 实验动物与药物SPF级雄性SD大鼠52只，体重质量为200g-220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，（许可证编号：SYXK京2017-0033）；实验大鼠置于北京中医药大学良乡校区动物房内饲养，饲养环境为22-25，适应性饲养2周。盐酸阿霉素（上海源叶生物科技有限公司，批号：H11S10Y97261）；他巴唑（上海源叶生物科技有限公司，批号：L16A9H58784）；真武汤（组成：附子20 g、茯苓15 g、白芍15

10、g、白术15 g、生姜6 g，北京上医人家）。1.2 实验试剂与仪器戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，020402）；BCA法蛋白定量试剂盒 (（普利来基因技术有限公司，P1511)）；液体样本总蛋白抽提试剂盒（普利来基因技术有限公司，P1255）；苏木素染液（Solarbio，20190724），伊红染液（Solarbio，20190805），Masson三色染色试剂盒（Solarbio，20200630），mikr002r型低温高速离心机（Hettich公司）；vortex-5型涡旋振荡器（北京东南仪诚实验室设备有限公司）；华卫德朗DR-200BS酶标仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）；迈瑞BS-

11、420全自动生化仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；MS205DU型精密电子天平（Mettler公司）；L340099型光学显微镜（日本Olympus公司）。2 方法2.1 病证结合动物模型制备与分组52只SPF级雄性SD大鼠，适应性饲养2周。随机分为正常组10只、模型组42只，第三第3、四周4周进行盐酸阿霉素尾静脉注射制备慢性肾脏病模型，（第三第3、四周4周注射剂量分别为3 mgkg-1、4 mgkg-1），浓度2 mgmlmL-1。用代谢笼收集大鼠24 h尿液，24 h尿蛋白50 mg确认为CKD动物模型建立8。模型成功大鼠按体质量与尿蛋白进行分层随机，分为阿霉素组14只、他巴唑组14

12、只、真武汤组14只。第13周起，除正常组、阿霉素组外，他巴唑组、真武汤组予肾阳虚证复合因素他巴唑20 mgkg-1灌胃给药，其给药剂量参考国内研究9-,10以及前期研究结果确定。真武汤组灌胃剂量为5.39 g/(kg/d)-1天（根据Meeh-Rubner氏公式计算大鼠给药量，为成人临床用量的4.56倍）。复合因素加入后，各复合因素干预组上午他巴唑灌胃造模（2 mlmLkg-1），下午中药治疗组各组予真武汤灌胃（10 mlmLkg-1），正常组、阿霉素组采用相同体积去离子水灌胃，复合因素、真武汤干预12周。研究方案流程图见附图（附图）。2.2 观察指标2.2.1 大鼠一般情况观察每日对各组大鼠

13、精神状态、活动度、皮毛光泽度、饮食等情况进行观察。2.2.2 大鼠体质量与肾脏、脾脏、睾丸脏器指数测定 复合因素干预12周，对大鼠进行麻醉，取血，分离出大鼠肾脏、睾丸、脾脏，生理盐水冲洗，用滤纸吸干表面水分，电子天平称取脏器的重量，计算脏器指数（脏器指数脏器质量/体质量）。2.2.3 大鼠24 h尿蛋白定量 用代谢笼收集大鼠的24 h尿液（每4周进行一1次），记录尿量，用液体蛋白抽提试剂盒-II抽提尿蛋白，通过BCA方法测量尿蛋白浓度，计算24 h尿蛋白含量。2.2.4 大鼠体温测定 每4周使用红外测温枪将测温孔对准大鼠尾根部位，待读数稳定，连测3次，取平均值并进行分析。2.2.5 游泳耐力实

14、验直径80 cm高100 cm塑料桶，水深50 cm左右，水温24左右，各组大鼠依次放入桶中后立即计时，进行游泳耐力实验，大鼠头部沉入水中10 s未浮出水面认为大鼠体力耗竭，停止计时，记录大鼠游泳时间。2.2.6 肾组织病理变化实验24周后，各组大鼠1%戊巴比妥钠40 mgkg-1腹腔注射进行麻醉，分离各组大鼠肾脏，制备肾组织石蜡切片，进行 HE、Masson染色实验，于光镜下对各组大鼠肾组织病理变化进行观察。2.2.7 血清生化指标检测股动脉所取血液，常温静置2 h，4离心（2500 rpmmin-1/min）20 min，取上层血清，-80冻存。采用比色法检测Scr、BUN、UA、TC、T

15、G、TP、ALB、SOD水平，酶联免疫吸附法检测T3、T4、TSH、FSH、LH、T、E2、CORT水平。2.2.8 统计分析 使用SPSS 23.0软件进行数据统计，数据采用xS表示，组间比较采用单因素方差分析，若数据符合正态分布、方差齐使用LSD检验，方差不齐时使用Dunnetts T3检验，P0.05认为差异有统计学意义，P0.01认为差异有显著统计学意义。3 实验结果3.1 一般情况实验第4周，阿霉素造模大鼠逐渐出现双下肢水肿、毛色暗淡、体重下降；实验第20周左右，他巴唑组大鼠出现肾阳虚体征，如毛发枯槁、弓背、蜷缩、喜扎堆、懒动、肛周脏污、体型瘦小、行动迟缓；与他巴唑组相比，真武汤组大

16、鼠一般情况有所改善。阿霉素组死亡5只，他巴唑组死亡4只，真武汤组死亡4只。3.2 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体质量，肾脏、脾脏与睾丸指数的影响与正常组相比，阿霉素造模后第4周，其余各组大鼠体重显著下降（P0.01），阿霉素造模后第8周，其余各组大鼠体重下降（P0.05）；12周以后，他巴唑组与正常组相比体重显著下降（P0.01），真武汤治疗后体重明显升高（P0.01）（表1）。与正常组相比，阿霉素组、他巴唑组肾脏指数显著增加（P0.01），与他巴唑组相比，真武汤组肾脏指数显著降低（P0.01）。脾脏指数、睾丸指数各组间无统计学差异（P0.05）（表2）。表1 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠

17、体质量的影响(（xS，g)）组别n第4周第8周第12周第16周第20周第24周正常组10450.66.851505.310.071531.2005.989539.6005.749571.86.621593.37.836阿霉素组8407.6256.938457.50015.809475.62521.030484.37520.967501.37523.370547.529.109他巴唑组8404.2507.526450.516.76732434.37510.815443.7509.610446.62511.89848013.472真武汤组8409.2506.273450.87518.465511.

18、87512.002*527.50012.154*541.517.102 *575 18.256 *F10.9773.37911.07411.92812.977.691注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.01表2 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠肾脏、脾脏与睾丸指数的影响(（xS )）组别n肾脏（%）脾脏（%）睾丸（%）正常组100.6320.0250.1570.0040.6510.022阿霉素组80.8000.0520.1540.0160.6930.041他巴唑组80.8940.0570.1650.0050.7070.

19、033真武汤组80.6980.028*0.1430.0070.6490.016F8.0720.931.028注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.013.3真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠24h尿蛋白的影响与正常组相比，其余各组尿蛋白升高，差异具有统计学意义。第16周后真武汤组较他巴唑组与阿霉素组24h尿蛋白明显下降（P0.01）（表3）。表3 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠24h尿蛋白的影响(（xS ，mg)）组别n第4周第8周第12周第16周第20周第24周正常组1024.5651.54026.0461.72928.

20、8032.11125.3641.04725.226 1.56327.4241.996阿霉素组847.5925.31460.4451.918106.6726.681141.2786.243155.3004.776207.9145.141他巴唑组845.4344.23661.3394.467107.2443.504141.9976.422154.5614.167206.3584.946真武汤组847.6514.90760.8013.234106.9564.517103.4183.139*103.516 3.231*128.0433.826*F8.54639.29291.149162.273339.

21、028494.943注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.013.4 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体温、游泳时间的影响与正常组相比，第12周阿霉素组、他巴唑组体温降低，第16周、20周阿霉素组、他巴唑组、真武汤组体温显著降低(（P0.01)），第24周与正常组相比，阿霉素组、他巴唑组体温显著降低(（P0.01)），真武汤组体温降低(（P0.05)），与他巴唑组相比，真武汤治疗后体温有升高趋势；与正常组相比，其余各组游泳时间均降低，差异具有显著统计学意义（P0.01）。与他巴唑组相比，真武汤组大鼠游泳时间有升高趋势。（

22、表4）。表4 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠体温及游泳时间的影响(（xS ，)）组别n第12周第16周第20周第24周游泳时间（s）正常组1033.2500.06934.2000.18734.0500.15733.3000.111875.00048.417阿霉素组833.0630.11032.5880.11132.4130.07732.7000.146421.25061.010他巴唑组832.9630.11032.5880.10432.6130.13332.3750.142348.75087.776真武汤组833.4750.24433.0130.21732.8380.19632.8130.15

23、7506.50066.509F2.40322.90926.6518.29711.951注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.013.5 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠肾组织病理形态影响3.5.1 HE染色结果显示，与正常组比较，阿霉素组、他巴唑组大鼠肾小球系膜区增宽，系膜细胞增生，肾小管扩张或萎缩，存在蛋白管型，肾间质有大量炎性细胞浸润，阿霉素组球囊壁粘连；与他巴唑组相比，真武汤组肾间质炎性细胞浸润情况较少，系膜细胞增生、肾小管蛋白管型减少。见（图1）。正常组阿霉素组他巴唑组真武汤组图1 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠

24、肾组织病理形态影响（HE，400）3.5.2 Masson染色结果显示，与正常组比较，阿霉素组、他巴唑组肾小球毛细血管丛与球囊壁粘连，大量胶原纤维沉积于肾小球系膜区。真武汤组可见少量胶原纤维沉积于肾小球系膜区。见（图2）。正常组阿霉素组他巴唑组真武汤组图2 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠肾组织病理形态影响（Masson，400）3.6 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠肾功能的影响与正常组相比，阿霉素组Scr、UA升高，BUN显著升高（P0.01）。他巴唑组Scr含量升高（P0.05），BUN显著升高（P0.01），UA升高，与他巴唑组相比，真武汤组Scr、UA、BUN降低。（表5）表5 真武汤对

25、慢性肾脏病肾阳虚证大鼠肾功能的影响(（xS)）组别nScr (umolL-1/L)UA (umolL-1/L)BUN (mmolL-1/L)正常组635.5440.27966.7292.5864.8470.201阿霉素组641.7643.57571.0388.8056.7990.161他巴唑组642.6261.39678.7338.2557.1160.657真武汤组635.4382.61864.3193.2526.3980.452F2.7890.9835.761注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.013.7 真武汤对

26、慢性肾脏病肾阳虚证大鼠TC、TG、TP、ALB的影响与正常组相比，阿霉素组TC、TG含量升高（P0.05），他巴唑组TC含量升高（P0.05），TG升高，阿霉素、他巴唑组两组TP降低，ALB显著降低（P0.01）。与他巴唑组相比，真武汤组TC、TG降低，ALB含量升高（P0.05）。（表6）表6 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠TC、TG、TP、ALB的影响(（xS)）组别nTC (mmolL-1/L)TG (mmolL-1/L)TP （ (gL-1/L)ALB （(gL-1/L)正常组61.1770.1150.5540.09655.7053.24718.0040.981阿霉素组62.8120.

27、6731.1280.16449.5355.72612.6091.898他巴唑组63.0640.6120.9380.23949.0963.23812.6110.926真武汤组61.8060.2800.4960.03856.5891.74616.5451.213*F3.373.9081.1064.414注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.013.8 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清T3、T4、TSH、SOD的影响与正常组相比，阿霉素组T4、SOD显著降低（P0.01），TSH显著升高（P0.01）；他巴唑组T3、T4、

28、SOD显著降低（P0.01），TSH显著升高（P0.01）；与阿霉素组相比，他巴唑组T3、T4、SOD显著降低（P0.01），TSH显著升高（P0.01）；与他巴唑组相比，真武汤组T3有升高趋势，T4、SOD显著升高（P0.01），TSH显著降低（P0.01）。（表7）。表7 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清T3、T4、TSH、SOD的影响(（xS)）组别nT3 (ngmL-1/ml)T4 (ngmL-1/ml)TSH (uIUmL-1/ml)SOD (UmL-1/ml)正常组60.5400.01558.8650.3204.2480.06795.9570.958阿霉素组60.5690.016

29、29.8710.78810.0450.15738.4280.587他巴唑组60.2900.02823.5650.66811.3120.12915.7330.260真武汤组60.3440.04634.1040.748*9.1890.153*44.3561.034*F23.163553.052550.5611914.523注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.013.9 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清FSH 、LH、T、E2及CORT的影响与正常组相比，阿霉素组、他巴唑组FSH 、LH、E2显著降低（P0.01）。与阿

30、霉素组相比，他巴唑组FSH降低（P0.05），LH显著降低（P0.01）。与他巴唑组相比，真武汤组FSH、LH、E2显著升高（P0.01）。T、CORT各组间不存在统计学差异。（表8）组别nFSH (mIUmL-1/ml)LH (mIUmL-1/ml)T (ngmL-1/ml)E2 (pgmL-1/ml)CORT（gL-1/L）正常组618.1300.7396.9980.1951.4480.28974.7480.59936.9992.351阿霉素组613.9100.3945.5580.1301.3350.42944.2501.76236.5582.689他巴唑组612.0880.1155.23

31、50.0901.3290.20044.6620.37736.0640.805真武汤组618.1980.259*6.1990.068*1.8400.49361.5662.652*37.3362.221F48.326235.2360.42281.2870.066表8 真武汤对慢性肾脏病肾阳虚证大鼠血清FSH 、LH、T、E2、CORT的影响(（xS)）注：与正常组比较P0.05，P0.01；与阿霉素组比较P0.05，P0.01；与他巴唑组比较*P0.05，*P0.014 讨论目前，阿霉素肾病 ( （Adriamycin-induced Nephropathy, ADRN)） 模型是国内外公认的能较

32、好模拟人类微小病变及局灶节段性肾小球硬化的动物模型，阿霉素致病的主要机制包括3方面：一是阿霉素具有较强的细胞毒性，对肾脏细胞造成直接损害，致使nephrin蛋白分布发生异常变化，细胞骨架紊乱，导致足突细胞的形态发生变化；二是阿霉素化学结构中含有醌式结构，能够产生活性氧，使肾小球上皮细胞脂质过氧化，进而肾小球滤过膜的完整性遭到严重破坏，滤过屏障的病变造成持续的蛋白尿；三是阿霉素可激活诸多细胞因子、炎性介质，从而影响系膜细胞的增殖情况，使系膜基质不断增加，病理变化缓慢进展，最终形成肾小球硬化11。有研究报道，通过间隔1周经大鼠尾静脉两次注射阿霉素的方法，可以成功的复制出阿霉素肾病动物模型，病理及各

33、项生化指标变化均更稳定12，故本次实验采用间隔1周经鼠尾静脉两次注射阿霉素的方法，分次给药累加剂量为7 mgkg-1/kg。1979年沈自尹院士团队发现肾阳虚证患者存在下丘脑-垂体-甲状腺轴不同环节、不同程度的功能紊乱，甲状腺功能低下在肾阳虚病机学上占有重要的地位13。本研究中以他巴唑作为复合因素进行肾阳虚证动物模型的制备，他巴唑为甲状腺抑制剂，可以影响甲状腺激素的合成，使甲状腺功能减退，机体代谢紊乱，形成“虚寒状态”，从病理角度模拟甲状腺功能减退的肾阳虚模型14。陈小野教授15提出“证候的临床诊断依据有五个方面：症状、病因、治疗（反证）、相关因素、客观指标”。动物模型的诊断依据必须与临床证候

34、的诊断依据相适应。有研究报道16称以药物或手术方式所构建的病理肾阳虚证模型不符合病因而不纳入成模的评价标准，故病因不作为模型评价标准之一。本研究参考以上几方面并结合实际情况，主要从两个角度探讨慢性肾脏病肾阳虚证病证结合动物模型成功的评价标准：一是该病证结合模型应首先符合CKD疾病模型，二是该病证结合模型须符合肾阳虚证的证候表现，主要分为以下几方面：一是症状与体征，根据中药新药临床研究指导原则17中肾阳虚证的判断标准，通过观察动物的一般情况如体征来判断其与肾阳虚证的符合程度作为肾阳虚证建立成功的标准之一，白宛鑫等18依据中药新药临床研究指导原则制定肾阳虚体征指标判断标准，如体毛枯槁、报团少动、便

35、溏、体型消瘦。童骏峰等19主要根据该指导原则中肾阳虚证的判断标准，通过观察动物的外观表现来判断其与肾阳虚证的符合程度，确定模型是否成功，肾阳虚证动物主要表现为形体消瘦，竖毛拱背，毛发无光泽，精神萎靡等症状。二是客观指标，肾阳虚证存在下丘脑垂体及3个靶腺轴肾上腺、甲状腺、性腺不同程度、不同层次的功能紊乱6这一特点，如反映为下丘脑垂体肾上腺轴功能的CORT、ACTH、CRH下降；反映为下丘脑垂体甲状腺轴功能的T3、T4、TSH下降；反映下丘脑垂体性腺轴功能的指标，如在雄性动物中血清T降低，E2升高，LH、FSH水平升高16,20。此外，药物反证也可以作为病证结合模型评价标准的一部分，为判断辨证准确

36、性提供参考。真武汤是温阳化气利水名方，现代临床可广泛应用于慢性肾功能衰竭阳虚水泛21。近年来对真武汤的实验及临床研究发现，本方具有利尿、改善肾灌注, 提高内生肌酐清除率, 降低蛋白尿, 抗慢性肾衰等作用, 并且在慢性肾脏病中运用甚为广泛22，真武汤的使用符合本病证结合模型的病机。在本次研究中，阿霉素造模大鼠24 h尿蛋白50 mg，符合疾病成模标准。血清学检测结果表示，阿霉素造模大鼠Scr、BUN、UA升高，TC、TG升高，TP、ALB降低，表示造模大鼠存在肾功能、血脂、血清蛋白指标的异常，符合慢性肾脏病临床表现。HE染色、Masson染色结果表示，与正常组相比，阿霉素组、他巴唑组肾小球系膜区

37、增宽，大量胶原纤维沉积，系膜细胞增生，肾小管扩张或萎缩，存在蛋白管型，肾间质有大量炎性细胞浸润，阿霉素组球囊壁粘连明显，符合阿霉素制备慢性肾脏病疾病模型的病理表现，满足慢性肾脏病肾阳虚证模型评价的首要标准。从症状与体征方面来看，他巴唑组大鼠体征主要表现为毛发枯槁、弓背、懒动、蜷缩、喜扎堆、肛周污秽、行动迟缓、体型较为瘦弱、体重增长减慢，此外，本实验中对大鼠体温、游泳时间的检测结果表示，他巴唑组存在体温降低、游泳时间减少的情况，与研究23中肾阳虚动物体温下降、游泳时间减少的表现一致；从客观指标来看，与正常组相比，他巴唑组T3、T4降低，与肾阳虚证下丘脑-垂体-甲状腺轴抑制的表征一致，与欧阳轶强等

38、24的研究一致，本实验中TSH升高可能与该靶腺轴负反馈调节有关。肾藏精, 主生殖主要依赖肾阴、肾阳来实现，肾阳与生殖功能关系密切。有学者25认为，肾藏精、主生殖的作用与下丘脑-垂体-性腺轴的功能相似。大量研究表明老年人会出现生理性肾虚, 下丘脑-垂体-性腺轴发生明显改变，男性T水平呈下降趋势，而E2水平升高，性腺激素水平也能反映肾阳虚水平26。沈自尹院士27在临床中发现肾阳虚证患者E2与LH均明显高于正常对照组。有实验证明28，肾阳虚证大鼠血清GnRH、T含量显著减少, E2、FSH、LH含量显著升高。性腺轴激素激素水平与肾阳虚生殖功能密切相关，临床研究发现29，肾阳虚型男性不育症患者与正常对

39、照组相比，FSH、LH、E2升高，T降低。动物实验研究30中，肾阳虚证生精障碍大鼠血清T减少，FSH、LH升高。以上研究提示肾阳虚证存在丘脑垂体性腺轴相关激素的分泌紊乱，具体表现为T降低，E2、LH、FSH水平升高。本实验他巴唑组E2、LH、FSH水平较正常组降低，并且T无明显差异，与既往结果相比，尚不能认为阿霉素联合他巴唑造模拟合了肾阳虚证下丘脑-垂体-性腺轴的变化。阿霉素是蒽环类抗生素之一，它主要作用位点是细胞核，显著抑制DNA复制，诱导DNA损伤31。本次实验性腺轴各指标水平降低，可能与阿霉素抑制了性腺轴细胞的DNA复制、造成DNA损伤从而导致了性腺激素分泌减少有关。CORT是一种肾上腺

40、皮质激素，肾阳虚证与CORT分泌密切相关，本实验中他巴唑组CORT与正常组无统计学差异，表明本模型对下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响不明显。有文献报道32，阳虚证SOD活力下降，自由基产生与清除失衡，本研究中与正常组相比，他巴唑组SOD显著降低，表示病证结合模型大鼠存在一定自由基清除障碍。经真武汤干预后大鼠体征、24h尿蛋白、游泳时间、血清各指标均有不同程度的改善，病理结果显示真武汤组肾脏炎性细胞浸润情况减少，系膜区系膜细胞增生、胶原纤维沉积减少，肾小管蛋白管型减少。从药物反证的角度证明了该模型的可行性，也说明了真武汤对CKD肾阳虚证模型的作用机制主要体现在改善体征、降低蛋白尿、增加耐力、改善下丘

41、脑-垂体-甲状腺轴功能，升高血清SOD水平等方面。在本次研究中，造模周期较长，一是由于短时间他巴唑给药对大鼠体征影响不明显；二是为了稳定观察该模型的体征与评价指标。本次首次采用尾静脉注射阿霉素联合他巴唑灌胃制备CKD肾阳虚证病证结合动物模型，主要模拟了下丘脑-垂体-甲状腺轴功能低下病理状态的慢性肾脏病肾阳虚证模型，通过大鼠24 h尿蛋白、病理切片可知本次模型符合慢性肾脏病成模标准，通过大鼠体征、客观指标可知本次模型符合肾阳虚证的中医证候特征，结合真武汤药物反证，用药后大鼠慢性肾脏病肾阳虚证情况改善，证明了该模型的科学性和可行性。病证结合模型是当前中医药研究的关键科学问题，对于推进中医药现代化进

42、程具有重要的意义。肾阳虚证是慢性肾脏病的关键证候，本研究首次将阿霉素制备慢性肾脏病疾病模型与他巴唑制备肾阳虚证候模型相结合，建立符合人类慢性肾脏病“肾阳虚”证候动物模型。临床研究表明，肾阳虚型慢性肾脏病患者T3、T4含量较低，存在甲状腺功能低下，本研究为开展慢性肾脏病肾阳虚证甲状腺轴功能低下的研究奠定了实验基础、有利于进一步阐明病证结合动物模型慢性肾脏病肾阳虚证的生物学基础，为阐释中医药的作用机制和开发创新药物提供了较为理想的动物模型，这对于提高慢性肾脏病的诊治水平具有重要的指导意义。参考文献1Hwang S J, , Lin M Y, , Chen H C. . Prevalence of

43、chronic kidney disease in ChinaJ. . Lancet, , 2012, , 380(9838):214-214.2邓跃毅, 杨洪涛, 孙伟, 等. 慢性肾脏病主要证型的中医辨证与治疗J. 中华肾病研究电子杂志, 2013, 2(5):228-231.3吴国伟, 吴劼扬, 徐文君, 等. 慢性肾脏病与中医证型的关系探讨J. 浙江中医杂志, 2014, 49(0(8):565-566.4陈可冀. 病证结合治疗观与临床实践J. 中国中西医结合杂志, 2011, 31(8):1016-1017.5陈可冀, 宋军. 病证结合的临床研究是中西医结合研究的重要模式J. 世界科

44、学技术, 2006(2):1-5.6沈自尹. 中西医结合肾本质研究回顾J. 中国中西医结合杂志, 2012, 32(3):304-306.7耿芳, 忽星歌, 姜晨. 真武汤在慢性肾脏病中临床及实验研究进展J. 辽宁中医药大学学报, 2021, 23(4):213-216.8Wang N, , Wei R B, , Li Q P, , et al. . Protective effects of astragaloside in rats with adriamycin nephropathy and underlying mechanism. . Chin J Nat Med. , 2016,

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46、3宋洁, 李震, 于海芳. 从下丘脑-垂体-甲状腺轴研究肾阳虚证的现状及思考J. 时珍国医国药, 2009, 20(7):1809-1810.14唐维我, 张会永, 李芹, 等. 肾阳虚证动物模型造模方法及模型评价J. 世界科学技术-中医药现代化, 2021, 23(0(4):1317-1324.15陈小野. 实用中医证候动物模型学M. 北京：: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社. 1993:47-51.16崔凯恒, 嵇冰. 肾阳虚证动物模型现代评价指标研究概述J. 甘肃中医药大学学报, 2016, 33(1):75-78.17郑筱萸. 中药新药临床研究指导原则M. 北京: 中国医药科技

47、出版社，, 2002: 385-38818白宛鑫, 赵良友, 张娜, 等. 生淫羊藿与炙淫羊藿对肾阳虚证水肿模型大鼠的影响J. 中国实验方剂学杂志, 2019, 25(5):85-91.19童骏峰, 徐志伟, 杨元宵, 等. 腺嘌呤与氢化可的松所致大鼠肾阳虚证模型比较研究J. 中华中医药杂志, 2015, 30(11):3901-3904.20林朝阳, 郝建新. 肾阳虚与性激素的相关性研究进展J. 湖北中医杂志, 2006(10):55-57.21贺梦媛, 从竹凤, 王红, 等. 真武汤化学成分、药理作用、临床应用的研究进展及质量标志物的预测分析J/OL. 中华中医药学刊, 2021:1-17

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49、4(0(3):2-5+, 1.26肖静, 何立群, 高建东, 等. 腺嘌呤与氢化可的松大鼠肾阳虚模型造模方法比较J. 中国比较医学杂志, 2008(0(3):77-80.27沈自尹, 王文健, 陈响中, 等. 肾阳虚证的下丘脑垂体甲状腺、性腺、肾上腺皮质轴功能的对比观察J. 医学研究通讯, 1983(10):21-22.28苏洁, 陈素红, 吕圭源, 等. 杜仲及菟丝子对肾阳虚大鼠生殖力及性激素的影响J. 浙江中医药大学学报, 2014, 38(0(9):1087-1090.29胡海翔, 李昌成, 宋晓琳, 等. 肾阳虚型不育症患者生殖激素水平和精液参数的变化及其相关性研究J. 中国中医药科技

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51、 11(97):439-449. .32王钰霞, 陈魁敏, 郝伟, 等. 真武汤对阳虚小鼠作用的实验研究J. 中国实验方剂学杂志, 2001(0(1):48-49.阿霉素联合他巴唑诱导慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的建立与评价及真武汤干预作用的研究尾静脉分次注射阿霉素联合他巴唑灌胃制备慢性肾脏病肾阳虚证动物模型正常组阿霉素组他巴唑组真武汤组血清生化指标检测：Scr、BUN、UA、TC、TG、TP、ALB、SOD、T3、T4、TSH、FSH、LH、T、E2、CORT体温、游泳时间、肾组织HE、Masson染色大鼠一般情况、体质量与肾脏、脾脏、睾丸脏器指数、24h尿蛋白定量阿霉素联合他巴唑可以成功建立

52、慢性肾脏病肾阳虚证动物模型，真武汤干预作用也证明了该病证结合模型的成功建立，该模型主要模拟了慢性肾脏病下丘脑-垂体-甲状腺轴功能低下的肾阳虚证动物模型附图 阿霉素联合他巴唑诱导慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的建立与评价及真武汤干预作用研究方案流程图Establishment and Evaluation of rat Rat Model of Kidney-Yang Deficiency Syndrome of Chronic Kidney Disease Induced by Doxorubicin Combined with Thiamazole and Study on Interventi

53、on Effect of Zhenwu Decoction*Wu Yingjie, Zhang Xinxue, Zheng Pengfei, Zhang Mengmeng, Yang Tao, Jiao Tingting, Zhao Zongjiang*基金项目 *国家科技部重点研发计划资助项目 (2018YFC1704300)：“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：王拥军；国家科技部重点研发计划资助项目子课题（2018YFC1704304）：慢性肾脏病“肾阳虚证”辨证标准的系统研究，负责人：赵宗江。第一作者 吴英杰，在读硕士，从事中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究，E-mail： HYPE

54、RLINK mailto:1023404572 1023404572通信作者*赵宗江，教授, 博士生导师, 从事中医药防治慢性肾脏疾病分子机制研究，TelE-mail：zongjiangz 1（(School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicineschool of traditional Chinese medicine, Beijing university of Chinese medicine, Beijing, 102488, China)Abstrac

55、t: Objective: To explore the establishment method and evaluation of adriamycin combined with Thiamazole in rats with kidney yang deficiency syndrome of chronic kidney disease and the intervention effect of Zhenwu decoctionDecoction. Methods: 52 male Sprague Dawley rats with SPF weight of 200g-220 g

56、were randomly divided into normal group (n=10) and model group (n=42) after 2 weeks of adaptive feeding. The rats in model group were injected with adriamycin via tail vein at the weight of 3 mgkg-1 and 4 mgkg-1 respectively at the 3rd and 4th week to establish the rat model of chronic kidney diseas

57、e. The rats with successful model were randomly divided into adriamycin group (n=14), Thiamazole group (n=14) and Zhenwu Decoction group (n=14), according to body mass and urinary protein. From the 13th week, Zhenwu Decoction group was intervened according to 5.39 g / (kg/d) - 1. OWe observed the ge

58、neral situation of rats, weighed the body weight of rats every week, measured the 24 h urinary protein of rats every 4 weeks, detected the body temperature of rats with infrared thermometer, and detected the swimming time with rat swimming experiment. After 24 weeks, blood was taken from the femoral

59、 artery and the rats were killed. The weight of kidney, spleen and testis were measured and the organ index was calculated. HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of renal tissue. The levels of serum Scr, BUN, UA, TC, TG, TP, ALB and SOD were detected by colori

60、metry; The levels of serum T3, T4, TSH, FSH, LH, T, E2, CORT TSH, TSH, T4 and cor were detected by ELISA. Results: Compared with the normal group, the rats in the Thiamazole group showed typical signs of kidney yang deficiency, such as haggard hair, arched back, lazy movement, curling up, like to pi