《基因组学》课件第3章 基因组作图-2015

1、 基因组作图 genomic mapping第 3 章郑州大学生命科学学院马珊珊为何要基因组作图？基因组计划的主要任务是获得全基因组序列，基因组太大，必需分散测序，然后将分散的顺序按原来位置组装，需要图谱进行指导。基因组存在大量重复顺序，会干扰排序，因此要高密度基因组图。基因组计划的第一个环节-构建基因组图谱与基因组作图有关的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933摩尔根：发现染色体的遗传机制，创立染色体遗传理论 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962沃森和克里克：DNA双螺旋结

2、构发现限制性内切酶以及在分子遗传学方面的应用 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 The Nobel Prize in Chemistry 1958/1980 Sanger研究蛋白质的结构，成功地测定了胰鸟素的精细结构，因而获得了1958年的诺贝尔化学奖。60年代后他致力于RNA和DNA结构研究，其测定RNA和DNA序列的方法，1980年再度获诺贝尔化学奖。Arber WNathans DSmith HSanger F与基因组作图有关的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his inve

3、ntion of the polymerase chain reaction (PCR) method发现PCR方法Mullis F美国人伊丽莎白布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克绍斯塔克，以表彰他们“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。伊丽莎白布莱克本是卡萝尔格雷德的导师。与基因组作图有关的诺贝尔奖 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 这条轨道上的信息中蕴藏多少金钱呢？我国能在竞争中占据多少地盘呢？ 应用界标或遗传标记对基因组进行精细的划分，进而标示出DNA的碱基序列或基因排列的工作。 主要有遗传图、物理图、序列图、基因图。基因组作图基因

4、组作图的基本构想 在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的遗传标记，并将其定位在染色体的特定位置上，绘制基因组图。人类基因组四张图谱 采用遗传重组所得到的基因在具体染色体上的线性排列图称为遗传连锁图，简称遗传图。一、 遗传图谱（genetic map）遗传图谱的概念 通过计算连锁的遗传标记之间的重组频率，确定它们的相对距离，一般用厘摩(cM，即减数分裂的重组频率为1%)来表示。cM值越大，两者之间距离越远。一、 遗传图谱（genetic map）1、遗传作图的基础连锁分析 摩尔根总结了连锁和交换定律。然而一个重大发现是在实验工作的一名大学生(Sturtevant,1913)发现的：基因间交换（去

5、连锁）的概率与它们在染色体上的距离成正比例。两个基因距离越远，发生交换的机会越多。因而重组频率是衡量两个基因间距离的单位。少数例外：重组热点区域遗传标记的类型 基因标记 形态标记、细胞学标记、生化标记 DNA标记 RFLP、微卫星、SNP一、 遗传图谱（genetic map）2、遗传标记 遗传图有特征性的位置标记，用于表示基因组中特定顺序所在的位置。一、 遗传图谱（genetic map）3、遗传作图的方法 对果蝇和小鼠等物种的连锁分析，进行有计划的育种实验：观察后代重组率。 对不发生减数分裂的细菌的连锁分析：诱导同源片段交换，观察子代细胞重组率。接合：DNA从一个细菌到另一个细菌。转导：通

6、过噬菌体转移小片段DNA。转化：受体菌从环境中摄取供体细胞释放的DNA片段 对人的连锁分析，只能通过家系分析完成：分析家庭连续几代成员遗传标记与某基因（或某疾病）共同出现的频率。一、 遗传图谱（genetic map）3、遗传作图的方法 之 非减数分裂分析基因转移：转化、结合、转导一、 遗传图谱（genetic map）3、遗传作图的方法 之 家系连锁分析(PCR-电泳) 分析人类的连锁分析，只能通过家系分析来完成。即分析一定数量的疾病家系中连续几代成员中遗传标记与某基因共同出现的频率。 “1”片段与疾病基因连锁一、 遗传图谱（genetic map）3、遗传作图的方法 之 家系连锁分析(PC

7、R-电泳)人类家系谱显示了小卫星DNA等位基因的分离。在这张家系谱中有六对等位基因，但是任何一个人仅有一个（纯合）或两个（杂合）等位基因。 遗传图的偏离重组热点（recombination hot spot):染色体上某些比其他位点有更高交换频率的位点。近端粒区和远着丝粒区有较高重组率。性别之间也表现重组率的差异。双交换的出现，产生距离减少的假象。一、 遗传图谱（genetic map）一、 遗传图谱（genetic map）4、遗传图谱的用途提供基因在染色体上的坐标，为基因识别和基因定位创造了条件。 例如，6000多个遗传标记能够把人的基因组分成6000多个区域，连锁分析找到某一疾病基因与某

8、一标记紧密连锁的证据，可把这一基因定位于这一已知区域。遗传图的分子座标也是基因组物理图绘制的基础。人类1号染色体连锁图例子：D1S160图距连锁图基因及多态性位点的分布分辩率有限。覆盖面较低。遗传标记的排列有时会出现差错-准确性有限。5、遗传图谱的缺陷一、 遗传图谱（genetic map）二、 物理图谱（physical map） 用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。物理图更精细的图谱。物理图的构建是基因组测序的基础，有承上启下的作用。物理图与遗传图比较：基因间关系更准确（啤酒酵母3号染色体）。限制性酶切作图：切成片段，根据重叠序列确定酶切片段间连

9、接顺序，以及遗传标志之间物理距离。荧光原位杂交（FISH）作图：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置。序列标记位点（STS）作图：通过对基因组片段进行PCR和杂交分析，来对短序列进行定位作图。二、 物理图谱（physical map）（一）物理图作图方法重组群是相互间存在重叠序列的一组克隆。可根据重叠顺序的相对位置将各个片段首尾连接，构成连续顺序图。酶切后，以大片段基因组DNA为基本单位，以连续的重叠群为基本框架，通过遗传标记将重叠群排列于染色体上。二、 物理图谱（physical map）1、限制性酶切作图1.1 限制性酶切作图的原理完全降解：获得完全酶切片段的数目和大小的图谱。部分降

10、解：避免所有切口断裂的完全降解发生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。 比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。二、 物理图谱（physical map）1.2 部分酶切法测定DNA片段位置二、 物理图谱（physical map）例1：一10kb线状DNA分子经两种限制酶完全酶切后得如下结果：EcoRI 3kb、7kb ， EcoRI/HindIII 2、3、5kbHindIII 2kb 、8kb，将各限制酶位点绘制在DNA分子上。例2：同一10kb线状DNA分子，如果控制反应条件避免完全酶切发生，因仅有EcoRI或HindIII酶切，可产

11、生部分重叠片段，电泳结果有2kb、3kb 、7kb、 8kb 的片段，即体系中既有7kb片段也有8kb片段，两个片段有5kb的重叠。1.2 部分酶切法测定DNA片段位置EH2532837HindIIIEcoRIB253A限制性图谱二、 物理图谱（physical map）1.2 部分酶切法测定DNA片段位置局限性： 随着DNA长度的增加和酶切位点的增多，单酶切、双酶切及部分酶切产生的条带数成比例扩大，需要对大量的片段进行比对和组装。 限制性作图只能应用于较小的DNA分子，上限约50kb 染色体酵母人工染色体（YAC）重叠群筛选阳性YAC酶切 cosmid人工染色体重叠群阳性cosmid酶切质粒

12、亚克隆限制酶作图 计算机分析串联，获得大片段。二、 物理图谱（physical map）1.3 基因组限制性酶切物理图的技术路线即：基于克隆的基因组作图YAC载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体。YAC载体必须含有以下元件：端粒重复序列（TEL） 着丝粒（CEN）自主复制序列（ARS） pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1YAC载体的平均装载量为600 kb，改进的操作程序可插入1400kb的片段酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC）二、 物理图谱（physical map）1.3 基因组

13、限制性酶切物理图的技术路线cosmid，也称黏粒、柯斯载体，是人工构建的含有噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。pHC796400 bpTcrfragmentcosoriAprPstIBamHISalI黏粒（cosmid）二、 物理图谱（physical map）片段装载范围为31 - 45 kb1.3 基因组限制性酶切物理图的技术路线质粒（plasmid）二、 物理图谱（physical map）分子量小，拷贝数高操作方便片段装载范围数百bp到10 kb多克隆位点ori复制起始点筛选标记Amppolylinker1.3 基因组限制性酶切物理图的技术路线二、 物理图谱（p

14、hysical map）1.3 基因组限制性酶切物理图的技术路线基因芯片技术基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。一组寡核苷酸探针TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG

15、重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA二、 物理图谱（physical map）1.3 基因组限制性酶切物理图的技术路线基因芯片技术YAC重叠群1000kbcosmid重叠群40kb限制酶作图、分析质粒亚克隆1-10kb二、 物理图谱（physical map）5328521.3 基因组限制性酶切物理图的技术路线图像分析Detector 1Detector 2False-color differential image筛查后进行结构学和功能学验证FISH就是将一组不同颜色的荧光标记的小片段DNA分子（探针）与单个变

16、性的染色体杂交，在显微镜下分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的存在及其在染色体上的相对位置。探针间的位置关系提供了DNA序列与基因组图谱间的直接联系。二、 物理图谱（physical map）2. 荧光原位杂交（FISH）作图 （Fluorescent in Situ Hybridization ）二、 物理图谱（physical map）2. 荧光原位杂交（FISH）作图荧光原位杂交（FISH）作图要求染色体更细长为宜二、 物理图谱（physical map）3. 序列标记位点（STS）作图序列标记位点（Sequence tagged site,STS）:指一段短的DNA序列，通常长度

17、在200-500bp，核苷酸序列已知，在待研究的染色体或基因组中仅有1个拷贝。序列标记位点作图：通过PCR和分子杂交将特定DNA序列定位在基因组染色体区段中。最有效的物理作图方法 基本特性：唯一性两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来计算。二、 物理图谱（physical map）3.1 STS作图的原理 二、 物理图谱（physical map）3.1 STS作图的原理 酶切和部分酶切的制作重叠DNA片段。分析两个STS位点共存于

18、一个片段的概率（位置越近，共存机会越大），计算STS位点的距离（分离率），绘制图谱。二、 物理图谱（physical map）3.2 STS作图的方法 连锁分析的图距是根据交换率计算的；STS作图的图距是根据分离频率来计算的。蓝色标记绿色标记各种酶切片段根据片段上共存STS标记计算分离率蓝色标记分离率低，表明其间距近；绿色标记分离率高，间距远。一对连锁紧密的标记一对连锁不紧密的标记基因组物理图谱是DNA顺序测定的基础, 它是测序工作的第一步。为基因的定位、克隆与基因之间的相互关系分析提供了有效的途径。二、 物理图谱（physical map）3.3 基因组物理图谱的用途基因组物理图和遗传图必须

19、进行整合，物理图与遗传图比较：基因间关系更准确三、 基因组序列图（sequence map）全基因组随机测序战略（Celera公司）。以物理图为基础的，以大片段克隆为单位的定向测序战略（公共领域测序）。两种不同的基因组测序战略:两者的最大区别在于是否依赖于基因组作图。 先随机将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终利用超级计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。三、 基因组序列图（sequence map）1、随机测序战略全基因组鸟枪法从下至上的策略随机法测序优点：三、 基因组序列图（sequence map）对高性能计算的方法和设备要求非常高。最终排序结果的

20、拼接组装比较困难，尤其在部分重复序列较高的地方难度较大。经济、快速、高效，成本较低。不需预先了解基因组的任何情况，即使缺少遗传图或物理图也可完成整个基因组顺序组装。缺点：1、随机测序战略全基因组鸟枪法对于大基因组而言，可以先将基因组DNA分解为若干个较大的DNA片段，构建基因组文库。每个大片段克隆可以独立进行鸟枪法测序，亦可以组建重叠群后进行鸟枪法测序。因此称为克隆重叠群测序法。三、 基因组序列图（sequence map）2、定向测序战略逐个克隆法/克隆重叠群法从上至下的策略逐个克隆测序两种测序策略的比较“由下而上”“由上而下”对连续克隆系中排定的YAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装。遗传

21、图-物理图-亚克隆测序-计算机拼装。理想状况下，整条染色体就是由一个完整的重叠群构成。三、 基因组序列图（sequence map）几种不同生物基因组测序的策略： 大肠杆菌基因组测序重叠群法; 流感嗜血杆菌基因组测序鸟枪法; 果蝇基因组测序鸟枪法; 人类基因组测序重叠群法和鸟枪法; 水稻基因组测序 重叠群法和鸟枪法。三、 基因组序列图（sequence map）580kb的生殖道支原体基因组由5个人在8周内即可完成（1995年）。三、 基因组序列图（sequence map）人类基因组北方研究中心三、 基因组序列图（sequence map）生物基因组大小（bp）基因数（个）乙肝病毒HBV32

22、004支原体M. genesis 58万480大肠杆菌E. coli460万3200酵母S. cerevisiae0.12亿6000果蝇D. melanogaster1.37亿13000圆线虫C. elegans0.97亿19000拟南芥A. thaliana1亿25000实验小鼠M. musculus26亿30000人H. sapiens31.6亿30000已完成基因组测序的生物有3708种 -参考GOLD网站（2012.09）又称转录图谱，在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上，绘制的有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。基因图谱制作方法: 通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的

23、位置。 用cDNA或EST作为“探针”进行分子杂交，鉴别出与转录有关的基因。四、 基因图谱（gene map）大小：31.647亿bp，个体差异只有0.01%。基因总数为23万。1号染色体已定位基因数最多（2968）， Y染色体最少（231）。第22号已定位679个基因，这些基因主要与先天性心脏病、免疫功能低下和多种恶性肿瘤等有关。 人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”。基因组上大约有14的区域没有基因的片段。紧邻基因富集区处常有GC重复区，可调节基因活性。35.3的基因包含重复序列。重复顺序没有编码功能，参与染色体的结构形成和动态变化。四、 基因图谱（gene map）4.1 人类基因组研

24、究结果：四、 基因图谱（gene map）4.1 人类基因组研究结果：一个基因可产生多种蛋白质。人类基因数约为线虫或果蝇两倍，蛋白质为三倍以上。对白、黑、黄三人种进行大样本的全基因组测序和序列比较，探索人类基因组在不同人群中的多态性分布和变化规律。世界上第一个黄种人基因组序列图由华大基因研究院完成-“炎黄一号”。黄种人突变位点与白种人不尽相同，不能完 全照搬国外的诊断标准2007年10月11日 单体型（haplotype）:每条染色体上带有各个基因座上的某个等位基因。一条染色体上这些不同的等位基因组合就是不同的单体型。CGG/CAA/TGA/CGG四、 基因图谱（gene map）4.2 基因

25、组单体型6000bp中检出20个SNPsHapMap的科学基础是染色体上的SNP“板块”（block）结构。即：SNP在一段染色体上是成组遗传的，每个板块在进化上非常保守，在多世代的传递中极少发生DNA重组，其SNPs的构成在单个染色体上的模式，即单体型。（1）单体型图(Hapmap)的基础四、 基因图谱（gene map）4.2 基因组单体型是人类基因组的遗传整合图，将对基因组的研究更为全面、有效、准确、经济。有助于不同群体的遗传多态性研究，疾病与遗传的关联分析，致病基因的确定。对药物研发、筛选以及人群特点实现“量体用药”，提供了理论基础和技术储备。（2）基因组单体型图的意义四、 基因图谱（gene map）4.2 基因组单体型四、 基因图谱（gene map）4.3 表观遗传学图谱表观遗传学(epigenetics):研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变