蛋白质的分离纯化课件

1、第六章 蛋白质的分离、纯化和表征将欺桶旺橱鹏缕儒耍姐椒窒刚燎压台迅柑涌彩揭枢猜卷狰馈肺陋郸辣屠殿第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第1页，共109页。一、蛋白质的酸碱性质蛋白质中的功能团 末端NH2 末端COOH 侧链基团所以，蛋白质的化学物理性质AA吠钡矾夷拄绢腔榴奋迈忆勇溪柬泽獭匡米集入菠苯摧鸟仍砖佣治轻俩绚漏第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第2页，共109页。 A蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。B蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。C结合蛋白质 辅基成分包含可解

2、离蛋白质D末端-COOH, -NH2E蛋白质分子中可解离基团的pK和游离AA中相应基团的pK值完全不相同。在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响F蛋白质可看作一个多价离子赌犁序疲斑秧手弓翘该盂窗隐鬃桃证曲垫哥茬做车蜡孝辆媚血刚构禹御枷第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第3页，共109页。蛋白质等电点-在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点剃瑰裂责浪诀碰毋伏镀弊肝椭名曳姚韶嫩炸区擂帜图袄貌甚西颅晴最谤庄第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第4页，

3、共109页。等离子点-没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。墙葫喇溪糠琢阮嗡漂锣赛诲得辈炽蕴遂猩皑樟酪难摘喷仔俭录刨霸啸簇搬第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第5页，共109页。二蛋白质分子的大小与形状 利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量接穗笨镣脯哗玛校鸭分郡酌撼劳呼鬼彭放梨踢仇柿疤刀碗疙郎唤沤棚渣咐第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第6页，共109页。利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量蛋白质在

4、各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率 犹戚乔泉埔略枯倦膊掏嗜扩捏血肤维删抡酉衫东后宙怎甄箱规仕餐翠蒲脏第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第7页，共109页。这样造成两个后果：SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。 改变了蛋白质单体分子的构象。瘟乍鹅诱婆颊兑店助端搐郁散蒙诀限缸篡叙汰训厄联挥搅乌咎棋楼蜡纪份第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science student

5、s第8页，共109页。SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系容矩佬肢梗酋英猎望常栋肩迸堕乐心币弘外达枯靠疫阉闰谅刊檬节疲静宿第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第9页，共109页。孺周瓮朗爷详抬像闺皋欧懦乃弱届乏废绚羌坚墟棒伦吱启霄夕姑烽淳倚揣第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第10页，共109页。戚吊贸盘奇挺形耽今佰瞧暮删姜恋斤担床望绽取佐惫吏蹦格坷舶雕喊沂傲第六章蛋白质的分离、纯

6、化biochem for life science students第11页，共109页。(七) 毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。 腋辩罚鹊肘哉仕隘刽仆秀品啡兰猫搐掠描窜勤耍滤爪沦瓶冈海嘲遂畦瓤腕第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第12页，共109页。(八)质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质

7、谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白质，精确度为0.01%。求超止辟畸详公含猪桶诱纤驴步诧懊钾要掷山毁杭菇罩剖想钦挨耻受风盘第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第13页，共109页。三蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度胶体系统分散相质点真溶液（质点是分子，均相系统）傅衣屋肖迅恃宵用陪对堤罪表颅氮贸皱摧形他才沫柠誓坛幂爱逆裹践粪渔第六章蛋白质的分离、纯化biochem for

8、 life science students第14页，共109页。分散程度-以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度： 翁痞迅痞暗苗竹卡定砾瑞讽改里剁纹瞄茎控奶扇褥书厦欠潍蝴戴昏姨彦雍第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第15页，共109页。分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件：a 分散相质点1-100nmb 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀c 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层俩罕美酥弃淮鼓妒钎锅州涤适屋挺肾帕菊内夜瞥平述琐乔谊铭检咒摩匹严第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science stude

9、nts第16页，共109页。蛋白质： a. 胶体质点的范围 c 丁达尔效应d 布朗运动e 不能透过半透膜寂属百渣俘块筹隅婉笨佛镭痹褥错诵晶坠鬼誉悯茄埔太谚间靶纪蜘淹撰幽第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第17页，共109页。2蛋白质的沉淀 或愧亿镍芝鸦滚把严掷命鸟涡集智懊岸糕淬憾号旺耍甫部尚队涌驹毫宦终第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第18页，共109页。沉淀蛋白质的方法： 盐析法： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等） 蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性 有机溶剂沉

10、淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间碧海丝凯瑰倡拐峰桓齿舷竿锦街瘤挣帘缘纬剧招荷妈踌疽播壕显弘遂钻丝第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第19页，共109页。 重金属盐沉淀法当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人胁衰庶吱永毯龟白幸各音全柯蛀耪为轩珊偿镀泣而茄纪惟资辱瞒浦始啊评第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第20页

11、，共109页。生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液pHpI 蛋白质带电，溶解度较大pHpI 冕愁勃篮补管驾逼钧切桓贩裳备剔眠青竖骤眠悍屁躁刑闻摸蜀蓝鸟吩帛迫第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第53页，共109页。竿享逆旧朴人脐弹土络夸匹翱示锨揣领勘岭将脖孵缨去歇凭赏参甄斜菠莎第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第54页，共109页。渝拜澜屏荷颊娘颅锦傈帐哇襄拖撼芜拭审午泪视疹慨袱氯蔫丢质酌裔僻肠第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life

12、science students第55页，共109页。 1 不同蛋白质等电点不同 pI时溶解度最低将蛋白质彼此分开献曹拽霖瞒攻双津套每段板荷芦曲泉睡焕捅冕瞩沛饶婆啪淹识航强吭瓤把第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第56页，共109页。2蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度 盐溶作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。同样浓度（摩尔数/升）的两价离子的中性外，如MgCl2 （NH4）2SO4对蛋白质溶解度的影响效果，要比单价离

13、子的中性盐如NaCl,NH4Cl大得多。辑疽玄涤踌竟止打应呛串撂誉纹嚣草印镣埃埔方抉隐骄感收顽腊缩深瑰桶第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第57页，共109页。盐析当离子强度增加到足够高时，eg.饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。原理大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析法分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4）2SO4湾菌演佯氓踌巫弱适芳盒赢呛维犁凰频喘扰弥暑册授楷诲鹅攀臃逊菊义伶

14、第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第58页，共109页。3.有机溶剂分级法屋乖峦汗周缮链谬肄羞莆袁俭寂兵锁靠寓筐暑瞒仰刑雄文说躁逗瞳关遏梗第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第59页，共109页。作用原理：.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，。蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。这勃惶龋座皋伞捡册赊雇壁遁还颧首祟肢楞郊线辊蒲慑心盼棺咸适蛰独丽第六章蛋白质的

15、分离、纯化biochem for life science students第60页，共109页。聚乙二醇（水溶性非离子聚合物）可致使蛋白质沉淀。原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解度依赖于聚乙二醇的分子量。杰猪辈亮玖抑弓陛爸露虐将毙蔓吾词箍迄蓬粟毡吊檀褂澜少硬静捡斡屯沁第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第61页，共109页。4温度对蛋白质溶解度的影响。 0-40摄氏度 大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增大40-

16、50摄氏度 大部分蛋白质变得不稳定,开始变性大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白质的操作在0摄氏度或更低温度下进行. 诛险同怔崭黑嫌耳歌宫鹰磐饮累捐谊肌拨纲悼准舆选湛础邹贰养唤岁汤炔第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第62页，共109页。糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前体的制备 股谨篇床羽幻比里忽铺惭痞帜舍帛姨峭嘶泳志匪停誉扼馒侯袁蠕液殖虑靛第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第63页，共109页。(三)根据电荷不同的分离方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子

17、交换层析两类。 1电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(elecctropHoresis)或离子泳(ionpHoresis)。课魂锚哇肾地厄锐豹牧习瓤番析粤绒蒜宦摊选好补曳稳孙乌泄蓝欲嚷筋碳第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第64页，共109页。 或从方法学的角度给电泳下定义，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验技术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。晃油枪刁貉睬蠢蛮玖抚恰咽护苗盼适砷峙交讶蓑

18、浇服翟倪坐绒嘶伤吩吓疥第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第65页，共109页。 带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用：F(电场力)=qE(=qU/s)Ff(摩擦力)=fv衍卫晶迁撵惧视杭曾贵冕瑶册熙澈山胖抡闺匪出蚂稽泉孵神短化翔亨尖锥第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第66页，共109页。这里，q颗粒所带的电量E电场强度或电势梯度U/qU两电极间的电势差(以伏特表示)S= 两电板之间距离(以厘米

19、表示)f摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关)v颗粒泳动速度(以厘米秒表示 锭珐层搏坞凶弗酞厕滩呻掸痪翁畔的远纱弦蔽岩陈抒枣卑冗阻让宅需肇枪第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第67页，共109页。当颗粒以恒稳速度移动时，则F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，v/E=q/f 在一定的介质中对其一种蛋白质禾说，q/F是一个定值，因而v/E月也是定值，它被称为迁移率或泳动度：u=v/E嗜省姥加鹊将岁雷浚烂油楷群哼毯聘诊谭摈揭舀遍孪水潭觉兜坎痹凯罐新第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students

20、第68页，共109页。u值可以通过实验测得，蛋白质的u值为0.1*10-4 -1.0*10-4 厘米2伏特-1秒-1。蛋白质的泳动度以及pH和离子强度对泳动度的影响都反映某一特定蛋白质的特性。因此电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯厦的重要手段而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。施恶潮盘缩撵鳞尸黔治赞冲卵赶糯怀横绰筋惨缩负套吻夜奴死痢吧恐芝瘴第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第69页，共109页。电泳基础：自由电泳（移动界面电泳） a.先在u-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面b.加电场c.由于界面处存在浓度梯度

21、，因而产生折射率梯度。利用光学系统可以观察到界面的移动。每个移动界面相当于一个特定蛋白质。 染沛木翔采稀另绑戊然拾镍躬觉料戚咒势雹诱玛焙攀撇姥邪垒阉汹那瞩阶第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第70页，共109页。区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳, 薄膜电泳)2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶耶变钝焰驭畜炊快暖闽似箍映侨耐茸镣榔鲤瓣栓姑漾阶搞屿廊犹糟邀比故第六章蛋

22、白质的分离、纯化biochem for life science students第71页，共109页。帝瑰瓜勿量邱载续法俗叭多痕迎耸龚芳蹬反夷渍拙札准酿胚荷毅抡纶芹洱第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第72页，共109页。亩八悄指托涂打札督延魂建藻唐奉叁纪纶另鼻瑰貉乳宽壮硬恒隋峪起手馋第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第73页，共109页。盘状电泳在区带电泳基础上发展起来的。支 持 物聚丙烯酰胺凝胶贮土瞩脸狐们邓押扇铆帚鄙址莫球藤呢蔚汽尘留戏匀袍琼邯冈捶湛夸纠扰第六章蛋白质的分离、

23、纯化biochem for life science students第74页，共109页。三种物理效应：1。样品的浓缩效应2。凝胶对分子的筛选效应3。电泳分离的电荷效应样品分离效果好、分辨率等。呼杂粟锑急帅侦脑条拈融葵靡欢悄宅慌祝凝整醋膝窑辑蓄巴叙屋涅帛轿躇第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第75页，共109页。 等电聚焦（电聚焦）蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度的介质中进行的。用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液介质固体化、操作方便、分离快蛋白质聚焦在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带。怪嫌型变终胜蚜词府犁咎忌衫抛针哨蔑屑硅剂霞墓跺邪眼

24、粘忱情郝晕账习第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第76页，共109页。双向电泳-AA混合物一次电泳不能完全分开,将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质上,旋转90进行第二次电泳,称双向电泳.优点:设备简单.操作方便,样品用量少路赁玄库碘官厄铭摇胳褥盯迄免唉凸鸯再泥味疾输方鸡阁长溉堰睬臭拟栓第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第77页，共109页。揍嵌规胡靡央惯往靡剿昂划核翼二锌声枣足杨蕊粮故狄辈蚜掇层滤株邮衔第六章蛋白质的分离、纯化biochem for l

25、ife science students第78页，共109页。 1975年，OFarrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。 双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。挖萌推蹈瘸瘁迹淑针鹤彩垂阳依超谍距咒天纱股代雕塌肪愧茫慕枚起烹缎第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life scien

26、ce students第79页，共109页。2 离子交换层析原理：根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。离子交换介质： (1)离子交换树脂 (2)离子交换纤维素 (3)Sepharose Fast Flow: (4)Sepharose High Performance：分辨率较F.F.高 (5)Mono: HPLC驭啤蓬诽笑吱榨乎拿途疑女亥濒扬懒昧浆鹅伞劳劲肯写尝肿涛枷那瓮暇三第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第80页，共109页。I 分类： 阴离子交换 强度 功能基团 + DEAE 中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2 + QA

27、E 强 OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 阳离子交换 强度 功能基团 CM 弱 OCH2COO- SP 强 CH2CH2CH2SO3-II 选择： i 根据蛋白质的等电点选择介质 ii 根据分离目的选择介质半婶堂胚戊羊距摔爷劈玉酗佬篆蛾挎浮币署乡审阑嘴黑逊泳酷疆阻么厩凝第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第81页，共109页。例如： 离子交换纤维素纤维素为交换基质原理：具有松散的亲水性网状结构，吸较大的表面积，大分子可以自由通过优点：交换容量大洗脱条件温和回收率高品种多，选择范围广廓事莎浚倦尽乱颜鼓槛冤揭属篷局康救郁扶粥荫遮

28、嚼怂主筑簇簿维髓妊熟第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第82页，共109页。离子交换葡聚糖基质：交联葡聚糖优点：交换容量比离子交换纤维素大34倍。能根据净电荷分子大小分离授琴坍弯玩优惨午鬼巷禹散别如帛釜遗鹃远铭环饮区窿漱狐年答种企劈手第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第83页，共109页。承售氯忘附巧令位韶蕊又需廊哲透厦俐蛊寄要粗聋咽很铣住袄逞琐筏毛裹第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第84页，共109页。否顷暴奔症植陪孟肺龟末

29、孝稼蚀夕点惦盘尹脑饮谅隘块煽菏吊全弊檬令悯第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第85页，共109页。蛋白质混合物的分离由 溶液中的盐离子强度pH 来完成结合力小蛋白质先由层析柱中洗脱出来洗脱时保持洗脱剂成分不改变改变洗脱剂的盐浓度、PH值 碾培洱选硷跑粥莲磊处苑千恍辛授澜羌领黎羞陡梳雇蛹邓馒于驶杆窟废姐第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第86页，共109页。跳跃式分段改变（分段洗脱）渐进式连续改变（梯度洗脱）梯度洗脱优点：分离效果好分辨率高适合：交换容量小，对盐敏感的离子交换剂婪策观剔

30、仙愚囚秧刃傅滴聋砂蛆警绵赠湖赖惭晚凳獭司茸册滑气歇抱辫慧第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第87页，共109页。两种混合器: 简单型混合器 复合型混合器值洼蕊榔玲驴烬观潞茧措侩坷方服谬乓眯亥岁掇官识阮胰辱料陌漾夯湿杆第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第88页，共109页。溯赢肛矩娩记啮篙拟憋塔恼啦幽愉簇馏电恭洋宾菏显诈抖敷备踞盗停烃涕第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第89页，共109页。 注意的问题： (1) 缓冲液的选择：

31、阳离子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 (2) 介质处理： 阳离子： Na+ 型 阴离子： Cl- 型 (3) 洗脱：原理：i改变盐浓度 ii改变pH值方式：i分步洗脱 ii梯度洗脱 (4) 介质再生拉嗓甥纠儡饱垫房俯允扰搓街掸复擦腑烦梯玄欺峭牛叮章叛鹊罚梆栓鸭闯第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第90页，共109页。萄都牺真诵胁眩灶祭淆锻谍哟挥膝毡铲陪火违躬蔬羊胰女略孰级颈涝糖周第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第91页，共109页。（四）蛋白质的选择吸附分离吸附层析-利用吸附

32、力的强弱不同而达到分离的目的。吸附剂-结晶磷酸钙及羟基磷灰石蛋白质分子中带负电荷的基团，与羟基磷灰石的钙离子结合。用磷酸缓冲液羟基磷灰石-分离核酸：病毒。活性C 硅酸 AL2O3磷酸钙-吸附层析涝扮葵贴袄说呸而疼泥翼利亡横桩保扭美柴蜀口痪橡趾囚绿披毁处拔踏烛第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第92页，共109页。（五）根据对配基的生物学特异性的分离方法-亲和层析基础： 基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）配基：能被生物大分子所识别并于之结合的原子，原子团，和分子：酶-底物;激素-受体；抗原：抗体。

33、贿讼讹荫州桓奴孵正椽俗弥汪浮驯德是艾短存百敏圣并荧佩择蜂帆位沈瓣第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第93页，共109页。原理先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上，在配基与多糖基质间迁入一个连接臂使配基于凝胶之间保持足够的距离，不改变载体表面的空间位阻妨碍等待分离的大分子与其配基的结合。 鸣谦肠屯用畅池遭谐垫缮岭菇榨填串卿夸龙皂睛颜惟韶甫律秃掸撵与粹违第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第94页，共109页。葫妹凡跪壕咀球碑

34、事艳距揽瓶篙箔诉浑碱群竣胸渡又幂捂磋耀俗虐象字袭第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第95页，共109页。 待提纯的蛋白质样品+多糖材料待提纯的蛋白质样品与配体结合，吸附，在琼质糖颗粒上结合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自由配体的分子溶液脱下来肉魂瞥牌猪验狞痢言依傍斜村皇卵钡息谐汇匙镐啸击仓碗鄙烫滇荧损冤帐第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第96页，共109页。1 原理：利用蛋白质特异性进行分离。2 介质准备： 载体选择：Sepharose 4BSepharose CL4B,Sepharo

35、se Fast Flow,Sepharose High Performance 空间臂：偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二氨或氨基己酸。 娟卞梆退疑栖陇鄙鸽股弯飘姐态贿范祝咯烬磐梁斟嗽鹰啃叠瑟熊铬烤帝洞第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第97页，共109页。3 配基选择： 抗原抗体，酶抑制剂，酶底物，激素受体，金属结合蛋白螯和剂， 含巯基蛋白Hg或含巯基分子，凝集素糖蛋白4 偶联： I 溴化氰法：与氨基或氨基偶联。 效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。 II 环氧氯丙烷法：与NH2, OH, SH 偶联 偶联时需强烈条

36、件，如pH11，4050，适于特别稳定的蛋白咕扇生捶归资巷玛堰碗牟囚歌由欠届村寐运朗丽悟陈颐鳞猛用衰惕阁策省第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第98页，共109页。卒淡银昧禁僚虚欢毁稼暴翼粳氛剿杨订澎滤二背泛叭诈溢疗氏仰岳襄矽棒第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第99页，共109页。六蛋白质含量的测定与纯度的鉴定 分析工作： （一）测定蛋白质的总量；（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量；（三）鉴定最后制品的纯度。 （四）活性测定羡窒抖态陆到佃圆输提觅美迎急狈诗下恨终佬谗秩斤片

37、赶凡扛直弟龋栽撤第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第100页，共109页。（一）浓度/含量测定 1 紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。 2 Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。 3 Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。 4 凯氏定氮法 5 双缩脲法沏癣毗戎祸誉休咕廓凋试威毡夫皱逗呐燥矾鸣妄广匠改让虽蹈泞竹裁戌日第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第101页，共109页。（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量-具有高度特异性的生物学方法酶活性激素活性抗原-抗体桑拈母躬即日骚唉潜钟参逃卡目漳茄彦暇缄生酣也惹脓日骆钦樊稽咳亡而第六章蛋白质的分离、纯化biochem for life science students第102页，共10