酶免技术f教学内容课件

1、第十四章 酶免疫技术第一节 酶免疫技术原理及分类 一、技术原理 二、分类第二节酶免疫技术要点 一、酶和酶作用底物 二、酶标记抗体或抗原 三、固相载体第三节酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理第四节 酶免技术应用小结标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术一、标记免疫技术标记免疫技术 标记免疫技术指用示踪物标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并借助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定；可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体

2、反应进行定性和定位研究；也可对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。标记免疫技术免疫测定技术免疫组化技术示踪物及标记技术酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术化学发光技术金免疫技术生物素-亲和素免疫放大技术 放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记免疫技术核心试剂: 酶标记的抗体或抗原酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性、 放大性二、酶免技术原理及特点免疫技术： Ag +Ab AgAb 酶标记的免疫技术： Ag*+Ab Ag*Ab 标记物的作用有二：一是便于观察反应结果，二是提高测定的敏感性 特点：灵敏度高、特异性强

3、、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 酶免技术原理及特点三、酶免疫技术分类 酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均 相非均相（异相）固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理（一）、均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶扩大免疫测定技术EMITenzym

4、e-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫测定 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定EMIT示意图毒品(如吗啡及其衍生物) +溶菌酶 ；酶底物(藤黄微球菌)。酶的活性与待测样品中抗原的量成正比，测定酶活性以标准曲线推算出待测抗原的量。 CEDIA示意图酶的活性与待测样品中抗原的量成反比。分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物（二）、非均相酶免疫测定第二节ELISA的技术要点

5、基本原理1.抗原或抗体的固相化 ；2.抗原或抗体的酶标记 ；3.受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 三个核心试剂 免疫吸附剂（固相载体）酶结合物酶的底物 ELISA试剂盒组分（1）已包被抗原或抗体的固相载体；（2）酶标记的抗原或抗体（酶结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性

6、对照品和阳性对照品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。标记酶的要求： 纯度高、活性高 性质稳定 标记后不影响抗原或抗体的活性，也不降低酶的活性 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 酶的反应产物稳定，检测简便、快速 酶的底物易于配制保存，酶及底物安全、易得、价廉 一、酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶）（无色）亚铁血红素（辅基）（暗棕色）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶） OD值之比 （2.5-3.0）能被58%-62%饱和硫酸铵沉淀，pH3.5-12均较稳定 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 常用

7、酶酶和酶作用底物碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠粘膜AP 半乳糖苷酶（-Gal） 用于均相酶免疫测定 常用酶酶和酶作用底物另：葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙酰胆碱酯酶等底物选择：1.底物应该是无色，经酶催化后有明显颜色变化；2.所显色泽易于洗脱；3.显色后的产物要稳定，定量检测时所产生的有色物质应是可溶的；4.价廉、易得、无毒。酶和酶作用底物HRP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 常用底物酶和酶作用底物HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD四甲基联苯胺 TMB5-氨基水杨酸5-ASA 2,2-氨基-二(

8、3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 HRP的常见底物 酶和酶作用底物AP的底物 -Gal的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate）酶标记物 通

9、过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物 二、酶标记的抗体或抗原（一）抗原或抗体抗原要求纯度高，抗原性完整天然抗原、重组抗原和合成肽。抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。多克隆和单克隆抗体。结合剂要求：1.不影响酶及抗体或抗原活性；2.不产生干扰物质；3.结合效率要高；4.不出现非特异性反应；5.易得、价廉。（二）酶标记抗体或抗原制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定 ，不形成聚合物酶标记抗体或抗原制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法酶标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛

10、分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。 酶标记抗体或抗原 一步法：将25mg 纯抗体与5mgHRP 混合于0.1mol/L pH 6.8 的磷酸盐缓冲液1ml 中，4下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4下用0.05mol/L pH 8.0 Tris 缓冲液透析平衡，即可。 二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子

11、免疫球蛋白结合物。纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：Sephadex G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 三、固相载体要求 吸附性能好 不参与化学反应 不影响免疫反应性 空白值低、透明度高 固相方法简便易行，快速经济种类塑料制品 （微量反应板）微颗粒膜载体 固相载体将抗原或抗体结合于固

12、相载体 一般ELISA包被用的缓冲液都是偏碱性的碳酸盐缓冲液（pH9.6)，目的就是要让被包被的蛋白质暴露较多的阴性集团，更稳定的吸附到板子上。 包被coating包被与封闭用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附封闭blocking洗涤液与稀释液在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温-20磷酸缓冲盐水（PBS,pH7.4）。 终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸。常用的AP反应终止液为碳酸钠。四、固相酶免疫测定仪（酶标仪）比色测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样450

13、nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm第三节酶联免疫吸附试验 底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理终止5固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法

14、测抗原1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE间接法方法

15、 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法1、已知抗原吸2、加待检物3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗体吸2、加待检物3、加酶标的抗Ig4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法竞争法原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e

16、抗体(HBeAb)的检测 ELISA检测抗体的方法捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法捕获法 原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色 洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY 1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色第四节 酶免疫测定的应用均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。酶免疫