不同组织取材检测胃癌腹膜微转移的价值

1、不同组织取材检测胃癌腹膜微转移的价值 陈国强1 唐仕明2【摘 要】 目的 探讨大网膜、小网膜及盆腹膜不同组织取材在胃癌腹膜微转移检测中的价值。方法 应用实时荧光定量RT-PCR检测36例胃癌患者大网膜、小网膜及盆腹膜CK20mRNA，另以6例胃癌组织作为阳性对照，6例经腹手术非胃癌患者同类标本作为阴性对照，通过统计学分析研究三种组织取材方式在胃癌腹膜微转移检测中的应用价值。结果 36例胃癌患者中，大网膜检测阳性率为41.62%（15/36）、小网膜检测阳性率为13.89%（5/36）、盆腹膜检测阳性率为36.11%（13/36）。大网膜检测阳性率高于小网膜和盆腹膜，但与盆腹膜差异无统计学意义。

2、6例胃癌组织检测均为阳性，6例经腹手术非胃癌患者同类标本检测均为阴性。结论 大网膜检测胃癌腹膜微转移阳性率高于盆腹膜和小网膜，且取材方便，无副损伤及并发症，可作为组织取材首选方式。【关键词】 组织取材 检测 胃癌 腹膜微转移 The Value of Detecting Gastric Cancer Peritonum Micrometastasis with Different TissueChenGuoqiang,TangShimingAbstract Objective: To explore value of great omentum,small omentum and basin

3、peritonum in gastric cancer peritonum micrometastasis detection. Methods: Fluorescence quantitative RT-PCR was used to detect CK20mRNA in great omentum small omentum and basin peritonum 0f 36 gastric cancer patients , 6 cancer tissue were detcted as positive comparision and 6 benign disease abdomina

4、l surgery patients simillar tissue were taken as negative comparision.Stastical method was used to analyze all results . Results: In 36 cases,CK20mRNA positive rate of great omentum was 41.62% (15/36), small omentum was 13.89% (5/36) and basin peritonum was 36.11% (13/ 36). The positive rate of grea

5、t omentum of was higher than small omentum and basin peritonum,but differance between great omentum and basin peritonum had no stastical signfence .And 6 cancer tissue ware all positive while 6 benign disease abdominal surgery patients simillar tissue were all negative .Conclusion: Great omentum pos

6、tive rate was higher than small omentum and basin peritonum in detecting gastric cancer peritonum micrometastasis ,it was collected conviently and without vice-damage ,so it may be first choice of tissue sellection. Key words Different Tissue; Detecting; Gastric Cancer; Peritonum Micrometastasis 胃癌腹

7、膜微转移检测是胃癌微转移检测研究的热点，取材方式以腹腔冲洗液为主；组织取材较多采用盆腹膜，膈腹膜和大网膜有少量报道。而不同组织取材方式的对比研究尚少见报道，我们收集我院2009年8月至2010年3月36例手术治疗胃癌患者的大网膜、小网膜及盆腹膜，通过检测微转移发生情况探讨三种取材方式的应用价值，以期寻找一种更好的取材方式。资料与方法1.1病例资料 本组36例，男22例，女14例，年龄48-78岁，平均年龄63岁。均无肉眼腹膜转移，术后病理证实浆膜浸润13例，未浸润浆膜23例，均有淋巴结转移；低、中分化腺癌20例，高分化腺癌10例。另取6例非肿瘤开腹手术患者同类标本作为阴性对照，排除假阳性；3例

8、胃癌组织标本做阳性对照，排除假阴性。1.2实验室资料 7300 Real-Time PCR Systems扩增仪：购自美国Applied Biosystems 公司， MG96G梯度PCR仪：购自杭州郎基科学仪器有限公司。TaKaRa试剂盒：RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒（购自大连宝生物工程有限公司）。引物及序列：内参照基因-actinmRNA,引物序列：（上游）5-CAG AGC CTC GCC TTT GCC-3 ，（下游）5-ATG CCG GAG CCG TTG TCG-3；目的基因CK20mRNA引物序列：（上游）5-TTT GAT GAC CTA CAT A-

9、3，（下游）5-CTT CAT ACT TCT GCC TCA TTT C-3（由上海生工生物工程有限公司设计合成提供）。1.3 方法 1.3.1 标本收集 开腹后切口彻底止血，探查腹腔转移情况，有肉眼腹膜转移标本弃用；. 沿网膜血管1、2级分支切取小块网膜组织，距病灶最近处切取小块小网膜，盆底腹膜钳夹提起切取小块组织，标本分别肝素钠生理盐水（125mg加入250ml生理盐水稀释）漂洗去除血液，分别装入冻存管并标记后液氮冻存；. 胃癌大体标本离体后在癌灶中心外缘至病灶周边之间切取小块胃癌组织，液氮冻存；非胃癌阴性对照组织开腹止血后按上述方法切取并处理，分别装入冻存管并标记后液氮冻存。1.3.2

10、 实验方法 组织悬液制备采用冷冻研磨法，提取所有样本总RNA后-80冰箱保存。引物验证符合实验要求后，阴性对照和阳性对照在同一体系检测，取浓度和纯度均较高的胃癌组织作为标准品，以相对值最高的胃癌组织样本作为样本检测的标准品。样本检测分3次完成，标准品稀释104-108分装2管作为主副管绘制标准曲线。定量方法采用标准曲线相对定量，结合微转移定义，参照国际通用RNA质量与细胞数量的对应关系，以104稀释倍数的标准品（近似于10个癌细胞总RNA）检测值作为阳性判断标准（系统检测值为1），将内参基因检测值转换为0-2数量级，相对值1为结果阳性。具体操作按试剂盒说明进行。1.3 统计学方法 因样本含量4

11、0，组间差异比较采用Fisher确切概率法。2. 结果 2.1 三种组织取材检测阳性率 2.2 大网膜标本扩增曲线 阳性 阴性 P 阳性率大网膜（a） 15 21 0.405a-b 41.62% 盆腹膜（b） 13 23 0.028b-c 36.11%小网膜（c） 5 31 0.008a-c 13.89%3.讨论 胃癌是我国常见肿瘤，发病率和死亡率均占据恶性肿瘤首位。腹膜转移是进展期胃癌主要死因，胃癌腹膜转移的及时诊断并进行针对性的治疗是改善胃癌整体疗效的关键1。 胃癌腹膜转移诊断的主要取材方式是腹腔冲洗液，日本胃癌处理规约将腹腔冲洗液癌细胞的存在作为胃癌临床分期的独立指标，多因素研究也表明腹

12、腔游离癌细胞的存在是影响胃癌患者预后的独立因素2。但多数研究表明，腹腔游离癌细胞的存在并不一定发展为腹膜转移，因此，腹腔游离癌细胞检测对胃癌腹膜转移仅具有预测意义。组织取材检测相关报道相对较少，主要取材方式是盆腹膜，依据在于重力作用下腹腔癌细胞随腹腔液一起具有向盆腔聚集的趋势，故此处更易检测到腹膜转移。大网膜及膈腹膜取材也有少量报道。组织取材作为检测标本的意义在于对胃癌腹膜转移具有确定诊断价值，对于胃癌临床分期及治疗方案的判断能提供更精确的依据。动物实验表明，腹膜乳斑缺乏连续的间皮细胞并表达粘附相关的媒介分子，是腹腔恶性肿瘤腹膜转移的优先选择性位点，大网膜是乳斑含量最丰富的部位，因此腹腔恶性肿

13、瘤常首先转移至大网膜3。但在人体，这种现象尚少见专门的研究报道。多数胃癌位于小弯测，小网膜是距癌灶最近的腹膜部分。所以，胃癌腹膜转移较早发生的部位存在三种可能：乳斑含量最多的大网膜，站立时位置最低的盆腹膜，或距肿瘤最近的小网膜。我们的研究以上述三种组织作为检测对象，采用灵敏度最高的实时荧光定量RT-PCR，以组织特异性较好的CK20mRNA为标记物，考察癌细胞转移的发生情况。我们的研究表明，大网膜检测阳性率为41.62%，高于盆腹膜和小网膜。Sakakura 等4利用RT-PCR 技术发现胃癌大网膜乳斑上CEA mRNA 阳性率为53. 3 % ,而同时检测腹腔冲洗液CEA mRNA 的表达率

14、仅为33. 3 % ,认为此方法对预测腹膜转移较腹腔冲洗液及传统细胞学为优。Kodera 等5以CEA mRNA 为检测靶点,利用实时RT-PCR 技术检测90 例胃癌患者网膜组织及腹腔冲洗液,并进行传统细胞学检查,3 种检测方法的灵敏度、特异度分别为46 %和90 %、77 %和94 %、31 %和100 %。认为以网膜为检测对象查找癌细胞是一种有前途的新方法。我们的研究与上述报道相似。尽管在本研究中，大网膜与盆腹膜阳性率差异不显著（P0.05），但大网膜作为胃癌术中常规切除的组织，不仅取材方便，而且不会引起副损伤及出血等并发症，可作为组织取材检测胃癌腹膜转移的首选方式。不过，大网膜乳斑主要

15、分布于网膜1、2级分支血管附近6，此处取材无法完全避免血液污染。但胃癌患者血液中即使存在微转移，含量也较低，如果同时进行血液样本检测，则能更好排除假阳性。另外，由于纳入病例较少，我们未进行大网膜转移与临床病理因素关系的分析，需进行更广泛的研究以得出更科学的结论。参考文献1. 何运胜姜淮芜，进展期胃癌多模式治疗的研究进展，中国普外基础与临床杂志.2008，1 （15 ，1） ：31-342. 陈峻青.日本胃癌处理规约第13版重要修改内容简介J.中国实用外科杂志，2000，20(1)：60-623. Yoshinari Mochizuki1, Hayao Nakanishi2, Yasuhiro

16、Kodera3, et.al .TNF- promotes progression of peritoneal metastasis as demonstrated using a green fluorescence protein (GFP)-tagged human gastric cancer cell line J .Clinical & Experimental Metastasis ，2004,21: 394. 吴涛.胃癌腹膜转移预测和治疗进展J. 国外医学肿瘤学分册，2005，32：61. 5. Yoshitaka Yamamura1, Seiji Ito1, Yoshinari Mochizuki1, et.al Distribution of free cancer cells in the abdominal cavity suggests limitations of bursectomy as an essential component of radical surgery for gastric carcinoma J .Gastric Cancer ,2007,10: 24. 6. Nicola Di Paolo,1Giovanni Sacchi, G