柱前衍生高效液相色谱法同步检测生鲜肉中过氧乙酸和过氧化

1、柱前衍生高效液相色谱法同步检测生鲜肉中过氧乙酸和过氧化氢残留收稿日期：作者简介：陈东宇（1986），女，硕士，研究方向：畜产品质量安全。*通讯作者：汤晓艳，（1976-），女，副研究员，研究方向：畜产品质量安全，邮箱： HYPERLINK mailto: ；孙京新，（1971），男，教授，研究方向：肉品质量控制，邮箱： HYPERLINK mailto:jxsun20000 jxsun20000。基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目课题（2009BADB7B07）陈东宇 1,2 汤晓艳1* 孙京新2* 王敏1 金芬1 毛雪飞1 1(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质

2、量安全重点实验室，北京 100081）2(青岛农业大学，山东青岛 266109）摘要：本研究利用柱前衍生方法建立了一种同步检测生鲜肉中过氧乙酸和过氧化氢残留的高效液相（HPLC）色谱法。样品经乙腈超声提取，加三苯基膦（TPP）及1-甲基-4-甲硫基苯（MTS）衍生，除脂，过SPE C18小柱，过0.22m滤膜后上机检测。高效液相色谱法采用粒径为5m固相填充料的Agilent C8色谱柱，乙腈水溶液梯度洗脱，流速为0.6mL/min，二极管阵列检测器检测，外标法定量。根据最低添加浓度和3倍信噪比设定得出过氧化氢（H2O2 ）最低检出限为0.01mg/L，过氧乙酸（PAA）最低检出限为0.015

3、mg/L。该方法首次实现生鲜肉中过氧乙酸和过氧化氢残留的同步检测，方法准确、灵敏度高、重复性好，可以满足生鲜肉中过氧乙酸和过氧化氢残留监测的需求。关键词：高效液相色谱；柱前衍生；过氧乙酸；过氧化氢；生鲜肉1 引言过氧化氢和过氧乙酸均系广谱、速效、高效灭菌剂，二者均有强氧化剂性，可将菌体蛋白质氧化而使微生物死亡，因此在食品企业中，过氧化氢及过氧乙酸主要作为加工助剂被用于食品冷冻库及食品用工具、设备及地面的消毒1。但是现在有些不法商贩将过氧化氢或过氧乙酸直接用于处理食品，如近年来出现的“北京美容猪蹄事件”，就是将劣质猪肉用过氧化氢漂白，加火碱使之膨大，再用亚硝酸钠发色，冒充优质猪蹄销入市场2。过氧

4、化氢和过氧乙酸对人体健康伤害很大，具有急性毒性、致癌、致突变特性，对呼吸道有强烈刺激性，口服会出现腹痛、胸口痛、呼吸困难、呕吐、体温升高、一时性运动和感觉障碍等症状3,4。为此，卫生部在2011年修订的GB2760食品添加剂使用标准中废止了将过氧乙酸和过氧化氢作为食品加工助剂的使用要求5，同时国家质检总局也发布公告，不再受理包括过氧乙酸和过氧化氢在内的33种产品的食品生产许可申请6。目前，对于过氧乙酸和过氧化氢的测定方法主要有滴定法7、分光光度法8、荧光法9，10、化学发光法11、电化学法12,13,14及色谱法15,16,17。但这些方法大多针对于消毒水中高浓度成分的检测，如滴定法、分光光度

5、法，灵敏度低、干扰因素多、不适用于食品中微量残留的测定；而荧光法、化学发光法、电化学法操作繁琐、反应条件不易控制、普及性差；色谱法灵敏度高、连续操作性好、使用范围广，可以精确定量微量残留，但尚未见有在食品中同步检测两种物质的方法报道。本文采用柱前衍生高效液相色谱法同步检测生鲜肉中过氧乙酸和过氧化氢残留，为食品尤其是生鲜肉质量安全检测监管提供技术支撑。2 实验部分2.1 仪器、试剂与材料Waters 2695高效液相色谱仪，配2998二极管阵列检测器（美国Waters公司）； Agilent C8 色谱柱（150mm2.1mm i.d.,5m，美国Agilent公司）；SPE C18固相萃取小柱

6、（美国Agilent公司）；微孔滤膜（0.22m，美国Fisher 公司）；台式高速冷冻离心机（德国贺力氏公司）；高速组织分散机（德国IKA公司）；冷冻研磨机（德国IKA公司）；KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WRTEX-5涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；雷磁 PHSJ-3F pH计（上海精科仪器有限公司）；MilliQ 超纯水器（法国MILLIQ公司）；电子天平（XS105DU,瑞士梅特勒公司）。三苯基膦标准品（TPP）、三苯基氧化膦标准品（TPPO）、1-甲基-4-甲硫基苯标准溶液（MTS）、甲基苯基亚砜标准品（MTSO）（美国SIGMA-ALDRIC

7、H公司）；过氧化氢标准溶液（1000mg/L，天津市光复精细化工研究所）、过氧乙酸（16%18%）（分析纯，使用前标定）；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC 级，美国Fisher 公司）；其他药品均为分析纯；实验用水为Milli-Q超纯水。生鲜鸡肉购置超市。2.2 标准溶液配制及标定 MTS、MTSO、TPP、TPPO标准贮备液的配制：用乙腈分别溶解MTS、MTSO、TPP、TPPO标准品，配制成10mg/L的MTSO、TPPO标准贮备液和100mg/L MTS、TPP的溶液。制作标准曲线时，将MTS、MTSO、TPP、TPPO标准贮备液配制成不同浓度的标准工作液。过氧化氢及过氧乙酸标准溶液须要现用

8、现配，并在使用前标定其浓度18,19。2.3 样品前处理提取：将生鲜鸡肉用冷冻研磨机绞碎，准确称取3.00g破碎肉样，加7g无水硫酸钠匀浆1min，10mL乙腈超声提取10min， 4条件下10000r/min离心10min，取上清液；将沉淀再次重复上述步骤提取，取上清液，合并两次上清液，加磷酸盐缓冲溶液并调pH至55.5之间。衍生：柱前衍生参照Ulrich Pinkernell16的方法，取5mL提取的上清样液，加入过量MTS溶液，与样液中过氧乙酸避光反应30min生成MTSO；再加入过量TPP溶液，与样液中过氧化氢避光反应20min生成TPPO。净化：用正己烷除脂，然后过经活化的SPE C

9、18小柱，弃去前1mL，收集过滤液，再过0.22m的滤膜，制成样品溶液上机待测。2.4 色谱条件色谱柱：Agilent C8 色谱柱（150mm2.1mm i.d.,5m）；流动相：A为乙腈、D为水；流速：0.6mL/min；梯度设置：03min，40% A；3.110min，60% A；10.112min，40% A；柱温：25；检测波长：225nm；进样量：20L。3 结果与分析3.1 色谱条件的确定本方法采用乙腈-水为流动相，采用梯度洗脱方式，具体参数见2.4。由于流动相乙腈比例较大时，TPPO和MTSO的保留时间较短，难以和溶剂峰分开，故初始流动相乙腈：水最佳比例设定为40：60，MT

10、SO、TPPO目标峰在前3min内洗脱出来；同时衍生剂MTS、TPP出峰较慢，为了加快洗脱时间，在3min后加大了乙腈比例，乙腈：水最佳比例为60：40。流动相流速选择发现流速为1mL/min、0.8 mL/min时TPPO、MTSO出峰较快，不易于与溶剂峰分离；流速为0.6 mL/min时，目标峰与溶剂峰分离效果较好。图1为是确定的乙腈-水梯度洗脱，流速为0.6 mL/min时 MTSO、TPPO、MTS、TPP的高效液相色谱图， MTSO、TPPO、MTS、TPP的保留时间分别为1.098min、 2.948min、5.544min、10.219min。1.MTSO2.TPPO3.MTS4

11、.TPP图1 最佳色谱条件下MTSO、MTS、TPPO、TPP的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromagram of MTSO、MTS、TPPO、TPP in optimum condition3.2 提取条件的确定本研究分别采用磷酸盐缓冲液、乙腈：水（40:60）、纯乙腈提取生鲜肉中的H2O2、PAA ，结果显示，用磷酸盐缓冲液提取时， MTSO和TPPO的加标回收率达170%、203%，基质效应明显；同样，乙腈：水（40:60）作为提取液时，MTSO和TPPO的加标回收率达130%、147%，基质效应也很明显；而以纯乙腈提取时，MTSO和TPPO的加标回收率分别为79%、85%，

12、基质效应不明显。因此，本方法提取液选择纯乙腈进行低温超声提取生鲜肉中的H2O2和PAA。由于pH值5.0-5.5的环境可抑制过氧乙酸和过氧化氢的分解，还可以避免TPP被氧化，因此，本方法采用磷酸盐缓冲液作为提取环境pH值调节的缓冲体系，并将pH调节至5.0-5.5。3.3 衍生条件的确定本研究对衍生顺序、衍生反应时间、目标物与衍生剂反应配比及光照条件进行了考察。不同衍生顺序时MTSO、TPPO的生成量见图2。结果显示，先加TPP或同步加入TPP和MTS与H2O2及PAA反应时，虽然H2O2的衍生产物TPPO的生成量没有明显的增加，但是PAA的衍生产物MTSO的生成量却明显降低，而先加MTS反应

13、一段时间后，再加入TPP，两种衍生产物MTSO、TPPO的生成量都达到最大。不同衍生时间下PAA和H2O2的衍生情况见图3。结果显示，PAA和MTS反应30min左右MSTO生成量最大，H2O2和TPP反应20min左右TPPO的生成量最大。因此，PAA和MTS反应的最佳衍生时间为30min，H2O2和TPP反应的最佳衍生时间为20min。图2. 不同衍生顺序条件下MTSO、TPPO的生成量Fig 2 Different derivative order on the production of MTSO、TPPO图3 不同衍生时间下MTSO和TPPO的生成量Fig.3 Different d

14、erivative order on the production of MTSO、TPPO 图4 不同反应配比下TPPO的生成量 Fig.4 Different ratio of H2O2 and TPP on the production of TPPO 图5 不同反应配比下MTSO的生成量Fig.5 Different ratio of PAA and MTS on the production of MTSOH2O2和TPP及PAA和MTS反应的最佳浓度配比见图4、图5。由图可知，H2O2和TPP的反应配比为1:2时，TPPO的生产量达到最大；PAA和MTS反应配比为1:4时，MTSO

15、的生产量不再显著增加。因此，H2O2：TPP和PAA：MTS的最佳反应配比分别为1:2和1:4。3.4 方法的线性范围、检出限、回收率及精密度在优化的实验条件下，以初始流动相分别配制0.15-5.00mg/L MTSO、0.10-5.00mg/L TPPO系列混合标准工作液。以各相应组分峰面积(y) 对浓度(x，mg/ L) 绘制标准曲线。结果表明，MTSO、TPPO在各自的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数分别达到0.9971、0.9985。根据添加的最低浓度和3倍信噪比设定得出MTSO和TPPO的检出限分别为0.015 mg/ L和0.01 mg/ L。（表1）在1mg/kg水平下进行

16、加标回收试验，每个水平重复测定6次，MTSO的平均回收率为78.9%，RSD为2.7%；TPPO的平均回收率为82.6%，RSD为4.1%，说明方法的精密度较好。(表1)表1 MTSO、TPPO线性方程、相关系数、检出限、回收率及精密度Table 1 Linear equations , correlation coefficient s , LOD , recoveries and RSD名称线性范围Linear ranges(mg/L)线性方程Regressionequation相关系数Correlationcoeficiants检出限LOD(mg/L)添加浓度Added(mg/kg)回收

17、率Recovery(%)（n=6）相对标准偏差RSD(% )MTSO0.155.00y = 2E+06x + 586800.99710.015178.92.7TPPO0.105.00y = 9E+07x 6459230.99850.01182.64.14. 方法应用模拟市场上可能会出现的违法使用过氧化氢及过氧乙酸浸泡生肉的现象20，用0.5%的过氧化氢及过氧乙酸混合消毒液在4浸泡生鲜鸡肉30min。利用本研究方法测定鸡肉中H2O2和PAA残留量分别为0.3mg/L、1.08mg/L，色谱图见图6。MTSTPPMTSOTPPO图6 0.5%混合消毒液浸泡后生鲜鸡肉中H2O2、PAA残留检测色谱图

18、Fig.6 Chromatatogram of the residual for H2O2、PAA in fresh chicken treated with 0.5% disinfectant 本研究建立的生鲜肉中H2O2和PAA柱前衍生高效液相色谱是首次实现在生鲜肉中同步检测过氧化氢和过氧乙酸的残留，方法准确、精密度高、实用性强，能够很好地满足生鲜肉违法添加使用过氧化氢和过氧乙酸消毒液的监测需求，为食品尤其生鲜肉质量安全监管提供方法支撑。References1.Kitis, M., a review. 2004，Environ.Int. 30, 4755.2. HYPERLINK /a/2

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26、tect the Residues of Peracetic Acid and Hydrogen Peroxide in Fresh Meat with Pre-column DerivatizationChen Dong-yu1,2 , Tang Xiao-yan1* ,Sun Jing-xin 2*,Wang Min1,Jin Fen1,Mao Xue-fei11 (Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences/K

27、ey Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture,P.R.China ,Beijing 100081, China . 2(Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China）Abstract: A method was established for simultaneous determination of peracetic acid (PAA) and hydrogen peroxide(H2O2) in raw meat using pre-column derivatization high performance liquid chromatography(HPLC). Samples were ultrasonic extracted with acetonitrile and added meth