《遗传学》课件第12章 基因表达调控

1、第十二章 原核生物基因表达的调控本章学时数：3学时本章重点：乳糖操纵子模型何谓表达？ 表达涉及两个环节：转录、翻译. 基因工程中“高表达” high level expression，即高的蛋白质产量。基因的表达是受到调节控制的：经济性 安全性 有序性哪些基因被转录，转录的效率如何。mRNA类型，mRNA数量。蛋白质的类型，蛋白质的数量。特定细胞的功能和属性。细菌的乳糖代谢乳糖操纵子一、酶的诱导与阻遏 1900年，Dienert首次注意到酶的诱导作用，在酵母细胞的培养中，存在乳糖时，细胞产生与乳糖利用有关的酶；把细胞转移到含葡萄糖的培养基，这种酶即消失. 结论：底物的存在能专一地诱导酶的产生。

2、 当培养基中有乳糖（lactose），而无葡萄糖时，细菌中专门代谢乳糖的酶类就迅速增加。 乳糖（lactose）既是底物（substrate）又起到了诱导物（inducer）的作用。1953年Monod发现酶的阻遏作用 大肠杆菌培养基中的色氨酸阻遏了色氨酸合成酶的合成.同等诱导或同等阻遏:大肠杆菌合成色氨酸所需的酶，5个编码基因串联在一起，而且排列顺序也跟基因产物所催化的反应顺序相同。这种成串现象由Demerec等人于1955年首先观察到。 从1946年起及随后的10年，Jacques Monod、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及Andre Lwoff 对乳糖

3、代谢的遗传学和生物化学进行了系统的研究。 E.coli能以乳糖（葡萄糖-4-D-半乳糖苷）这种双糖作为唯一碳源。 乳糖进入细胞后被分解为半乳糖和葡萄糖. 与乳糖代谢有关的三种酶： -半乳糖苷酶：水解乳糖为半乳糖和葡萄糖； -半乳糖苷透性酶：一种膜蛋白，协助乳糖穿膜进入细菌细胞内。 巯基半乳糖苷转乙酰酶：将一个乙酰基从乙酰辅酶A转移到-半乳糖苷上。 三种酶的编码基因分别命名为lacZ 、 lacY和lacA，统称为结构基因，在染色体上相连在一起。lacZ：编码-半乳糖苷酶（-galactosidase）四聚体，分解乳糖。乳糖半乳糖+葡萄糖-半乳糖苷酶lacY：编码-半乳糖苷透性酶（permeas

4、ae）。膜蛋白，将乳糖转运到细胞中。 lacA：编码-半乳糖苷乙酰转移酶（transacetylase）。二聚体; 把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。 培养中C源不是乳糖时，三种酶在细胞内的含量很低，只有几个分子或不到。 如果用乳糖代替葡萄糖，则在几分钟内，每个cell转录出30-50个mRNA模板，产生3000多个-半乳糖苷酶分子，另两种酶的量也迅速增加，一旦乳糖耗尽，三种酶的合成同时停止。 这里，乳糖被当作诱导物，并被-半乳糖苷酶催化分解，一些不能被该酶分解的半乳糖苷也可作为诱导物，如IPTG （异丙基-D-硫代半乳糖苷） IPTG有诱导效应而本身不被分解，称为安慰诱导物(grat

5、uitous inducer) constitutive 不需诱导、持续地合成. 诱导型的合成（如-半乳糖苷酶也可能产生组成型突变体mutant） 乳糖操纵子模型有关的试验中，利用了： 组成型突变体 部分二倍体技术（性导, F因子）组成型合成Joshua Lederberg为了研究乳糖代谢的三个酶的基因，分离了大量的突变体（lac -），并经过遗传作图发现它们是紧密连锁的：Z-Y-A乳糖操纵子模型同时发现它们是被同时诱导转录的。 雅科Jacob和莫诺Monod根据试验事实提出了操纵子模型operon model。认为这三个酶的基因转录受一个开关单位的控制。操纵子模型（Operon Model）

6、1960年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，说明乳糖诱导代谢是一个负控制（negative control）。获1965年Nobel生理学和医学奖操纵子模型对乳糖诱导效应的解释 LacI 编码了一个阻遏物(repressor)，与结构基因附近的一个“假想”位置（命名为operator site）结合, 从而抑制结构基因的转录。 该阻遏物能变构（allosteric）。即它还能与乳糖结合，改变构像而丧失了与operator DNA结合的能力，结构基因才能够转录表达。 调节基因编码的产物是一种蛋白质分子，称为阻遏物。当培养基内没有乳糖时，阻遏物结合到操纵基因上，阻止了RNA聚合酶的通过，所

7、以结构基因得不到转录。 培养基加入乳糖后，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏物的构象改变。阻遏物的构象改变后，失去了与操纵基因结合的能力，阻遏物从操纵基因上解离下来。于是转录得以进行。 Jacob和Monod未提出启动基因区（RNA聚合物识别并结合的区域）P（Promotor，又叫启动子） ,后来由伊彭提出。 启动子：由两个盒组成，以转录起始点为+1，-35的TTGACA盒是RNA聚合酶的识别位点，-10的TATAAT盒（Pribnow盒），是RNA聚合酶的结合位点。 这样，操纵子的概念：最初的操纵子=操纵基因+结构基因，进一步成为 操纵子包括：启动基因+操纵基因+结构基因。 操纵子（ope

8、ron）: 功能相关的结构基因在染色体上成簇（cluster）排列, 由一个共同的控制区调控基因的转录,是原核生物转录调控的基本单位.由结构基因（structural genes）和上游相邻的控制区（regulatory region）组成。 一个操纵子转录后形成一个多顺反子mRNA(polycistronic)。对模型的遗传学验证组成型突变（constitutive mutants）没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。遗传作图发现：这种突变（lacOc）的基因紧密连锁在结构基因的上游（operator region）。另一个组成型突变（lacI-）作图的结果是在离结构基因不远处。野生型组

9、成型突变lacOclacI-根据操纵子模型的原理，可以预测：模型预测1. lacI基因产物是个可扩散的（diffusible）蛋白。2. O区（operator region）在调节过程中起作用，但不编码产物。3. O区必须紧靠结构基因。实验验证 Pardee、Jacob、Monod设计了历史性的实验来检验他们的模型的预测是否正确。1. 实验原理2. 实验过程通过F因子，给lacI-或lacOc的突变菌输入野生型lacI或lacO基因，观察其对-半乳糖苷酶活性的影响。实验1：组成型突变lacI- lacZ+F菌株F lacI+ lacZ-乳糖诱导型菌说明F菌株的lacI+能弥补原菌株的lacI

10、-缺陷。即：lacI 对lacZ是反式作用（trans-acting）。组成型突变lacI+ lacOc lacZ+F菌株F lacI+lacO+ lacZ-组成型表达实验2：说明F菌株的lacO+不能弥补原菌株的lacOc缺陷。即：lacO对lacZ是顺式作用（cis-acting）。实验3lacI超突变（lacIs）编码的阻遏物不能与乳糖结合，所以总是结合在O区的DNA上，使lacZ不能表达。野生型lacI+ lacZ+F菌株超突变F lacIs lacZ+组成型不表达说明超突变lacIs 编码的阻遏物能作用于野生型菌操纵子的O区。利用超突变：操纵子模型的意义Jacob和Monod1961

11、年发表的操纵子理论是遗 传学的的一个里程碑（landmark）。 用遗传分析结果推论出分子生物学模型并验证。 暗示了蛋白质与DNA结合的概念。描述了“阻遏物”的调节因子概念（尽管当时并不知道它是蛋白质还是RNA）。 当时人们刚知道mRNA，对转录的细节一无所知！附：阻遏物的分离和鉴定阻遏物的含量极少，每细胞不超过10份。直到1966年，Walter Gilbert和Benno Muller-Hill从lacI的超量突变菌株中，利用透析（dialysis）的方法，通过IPTG与阻遏物的结合作用，分离到了这个蛋白质。Gilbert及其同事又用放射自显影证明它能与lacO DNA结合。 分离鉴定放射

12、性标记的阻遏物能与野生型O区结合放射性标记的阻遏物不能与突变型O区结合Lac 阻遏物的空间结构两个binding domian:四聚体聚合区CN一个四聚体聚合区阻遏物与DNA的结合i）电镜观察Lac repressorii）X-ray分析两个单体结合在一个完整的lacO区；四聚体可以结合两个lacO。iii）DNA测序分析阻遏物所结合的DNA有26bp（-5 +21）。位于RNA多聚酶结合部位的下游内部。GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTATGmRNAproteinRNA pol binding siterepressor binding site对称轴乳糖操纵子的正调控（p

13、ositive control）Jacob-Monod 模型没能回答一个关键性的问题：为什么E.coli 在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（lactose）的培养基（medium）中不启动lac 操纵子的转录？Answers to this question emerged from molecular studies carried out long after publication of the operon theory.（1）正调控因子（positive regulator）在有些启动子上，RNA pol结合后并不能启动转录。必须一个激活因子（正调节因子）的帮助才能打开D

14、NA双链。CAP是lac operon的正调节因子。（2）CAP的作用原理 cAMP+CAP cAMP-CAP复合体 cAMP-CAP与lac操纵子启动基因上的一个位置结合后 ，RNA聚合酶才能与启动子结合。 cAMP是由ATP经过腺苷酸环化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。ATPcAMPAdenyl cyclase 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性，从而间接地抑制了Lac操纵子的转录。 CAP-cAMP系统在半乳糖和阿拉伯糖操纵子中也起作用。 葡萄糖浓度 cAMP 葡萄糖浓度 cAMP（3）CAP与DNA的结合lac操纵子中，CAP结合位点位于RNA pol结合位点的上游（-22bp）。结合部位位置不同的操纵子中，CAP的结合位置不同。operatorCAP promotor结构基因半乳糖乳糖阿拉伯糖结构基因operatorpromotorCAP operatorCAP promotor结构基因以二聚体形式与DNA结合。使DNA弯曲90度。结合形式TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG结合处DNA的保守序列回文顺序每一部分结合一