《仪器分析》课件第五章 分子发光分析法

1、光源单色器液池检测器单色器检测器I0ItIfUV-Vis:定量A=lg(I0/It)= kbc 定性 maxmaxem发光:定量If= kc 定性 ex, em分子吸收光谱法与分子发光光谱法的比较第五章 分子发光分析法 分子发光现象及类型 分子荧光的产生 荧光分析仪器 荧光效率及影响因素 磷光分析法及化学发光分析法 荧光光谱及定量第一节 方法概述一、分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法基态分子激发态分子hE生化反应化学反应光电基态分子激发态分子二、分子发光分

2、析法分类 三、分子荧光分析法的特点1. 灵敏度高 检测限荧光分析法比分光光度法低24个数量级？3. 实验方法简单2. 选择性好4. 待测样品用量少；仪器价格适中？5. 应用范围较广（尤其是生命科学领域）基因组测序第二节 荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光的产生1. 电子自旋状态的多重性ES0S1T1C=O基态单重态第一激发单重态第一激发三重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8S三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-41S2. 分子内各种光物理过程T1VR（10-1410-12 s）VRICS0S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：体系间窜跃F: 荧光P：磷光AA

3、VRICFISCP荧光寿命：10-910-6s磷光寿命：10-310s波长：AFPISC（10-1310-11 s）(2) 分子去激化（退激）过程a. 无辐射去激体系内的多余的能量以热的形式释放，不伴随发光现象的过程叫无辐射去激。振动驰豫(Vibrational Relaxation) 同一电子能级较高振动能级到较低振动能级内部转换（Internal Covertion） 相同的多重态之间的转换 S-S体系间窜跃（Inter System Crossing） 不同的多重态之间的转换 S-T(1) 分子激发（吸收）过程b. 辐射去激处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐

4、射去激 荧光（Fluorescence） 从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 磷光（Phosphorescence） 从T1最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光 * 易产生荧光n * 易产生磷光二、荧光效率及影响因素 f =发荧光的分子数激发态分子总数1. 荧光效率f Kf 为荧光发射过程的速率常数取决于物质的化学结构若以各种跃迁速率常数来表示 f 反映了荧光物质发射荧光的能力， f 越大，荧光越强.Ki 为非辐射跃迁的速率常数之和主要取决于化学环境，也与化学结构有关分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在0.11之间2. 荧光效率与分子

5、结构关系（1） 大的共轭键体系f ex /nm em /nm 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400 350线状结构比非线状结构的荧光波长长 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定 ex = 386 nm em = 430 nm3，4 - 苯并芘是强致癌物（2） 刚性平面结构较稳定的平面结构荧光素f=0.92酚酞f=0联苯f=0.18芴f=1大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定（3）取代基的类型-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2给电子

6、基团增强荧光吸电子基团减弱荧光-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH影响不明显的取代基-NH3+、-R、- SO3H重原子荧光减弱、磷光增强-F、-Cl、-Br、- I3、环境对荧光、磷光的影响(1) 溶剂的影响一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大(2) 温度的影响Kf基本不随温度变，而Ki随温度升高显著增大。低温下测定，提高灵敏度温度升高荧光效率下降(3) pH的影响影响荧光强度和波长(5)水中溶解氧(4)表面活性剂的影响降低荧光效率*非极性溶剂中极性溶剂中E非E极四、荧光强度与荧光物质浓度的关系If荧光强度Ia吸收的辐射强度I0入射光强度 If = f （

7、I0- I010-A） = f I0 （1-10-A ）I = I010-A将上式展开If = f Ia= f （I0- I ）当A0.05时：If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 bc对一给定物质，当激发光波长和强度一定时， f 、I0、 和b为常数，合并为K If = KC定量分析依据1、定量关系式只有在极稀的溶液中荧光强度与物质浓度呈线形关系If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 bc浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If反而降低，发生荧光猝灭效应荧光测定的是微量或痕量组分，灵敏度高A0.052、荧光猝灭(1) 涵义：荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化

8、学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率f 下降称为荧光猝灭。(2) 荧光猝灭剂：使荧光强度降低的物质氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂(3) 荧光机理：碰撞猝灭M +激 M*M* + Q M + Q +热自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象光源激发单色器液池检测器发射单色器检测器放大器及记录器exemI0五、荧光分析仪器与荧光光谱ItIf高压汞灯和氙弧灯光栅石英材料的方形池光电倍增管1. 荧光分析仪器2. 激发光谱和发射光谱(1) 激发光谱: 是在固定荧光波长(em)下，测量荧光体的荧光强度随激发波长(ex)变化的光谱。(2) 发射（

9、荧光）光谱: 是在固定激发波长下，测量荧光体的荧光强度随发射波长变化的光谱。激发光谱实质上是荧光物质的吸收光谱。荧光光谱与激发光谱呈镜像关系(nm)3. 性能 选择性荧光分析法与紫外可见吸收法的异同2. 仪器 灵敏度 1. 原理 UV-VismaxFex ；emT=It/I0If = 2.3 f I0 bc增大激发光强度使用灵敏度更高的检测器吸收法只能选择吸收波长荧光法不仅能选择激发波长；还能选择发射波长400360040第三节 化学发光分析法化学发光是利用化学反应所产生的光辐射现象所建立的分析方法一、概述化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的化学能化

10、学发光分析具有以下特点：灵敏度高线性范围宽仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限 发光机理有待进一步研究二、化学发光分析的基本原理(2) 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态1. 化学发光反应的基本条件(1) 化学反应必须产生足够的化学能A + B C* +D具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求C* C + h 产物接受反应能被激发在可见光区观察化学发光，需170-300kJmol-1激发能。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应中2. 化学发光效率和发光强度(1) 化学发光效率CL激发态分子的化学效率激发态分子的发光效率F 与荧光效率

11、的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响激发态分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数参加反应的分子数发射的光子数=frCLr 取决于发光所依据的化学反应本身具有高效率的化学发光是生物体中,亦称生物发光。 如：萤火虫发光反应的效率几乎接近100%。 非生物体的化学发光效率一般不超过1%(2) 化学发光强度对下列化学发光反应： A +B C* +D C + h化学发光强度ICL(t)与反应速度、化学发光效率有如下关系dtdctICLCL=j)(A为待测物质，C为发光物质，当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时，发光反应可视为一级反应定量依据3. 化学发光反应的类型(1

12、) 液相化学发光 研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（Luminol）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺（3 氨基苯二甲酰环肼）可以测定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.01-0.05鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些痕量的过渡金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可测定Co（）,Cu（）, Ni（）, Cr（）等 50余种元素。鲁米诺化学发光体系还可用于许多涉及到H2O2的产生或H2O2参加反应的生化分析研究(2) 气相化学发光可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。NO + O3 NO2* + O2 NO

13、2* NO2 +h CO + O（原子氧） CO2* CO2* CO2 +h （600nm）（=300500nm）四、化学发光分析仪器（自学）气相化学发光反应主要用于某些气体的监测，有专用的监测仪。主要讨论的是液相发光分析仪器按进样方式分立取样式和流动注射式化学发光仪1. 分立取样式是一种在静态下测量发光信号的装置，它利用移液管或注射器取一定量的试剂与试样加入发光反应池中混合，或把试剂与试样加入贮液管中，开启塞子使溶液流入反应池中混合，化学发光反应立即发生，发光信号通过光电倍增管检测，记录下发光强度。根据发光峰面积的积分值或峰高进行定量分析仪器具有设备简单，造价低，体积小，灵敏度高等优点缺点：手工进样重复性差，测定精密度不高；难以实现自动化，分析效率低2. 流动注射式是动态测量法，试液和试剂通过蠕动泵传送，并在流动中进样混合，恰好流动至盘管中反应发光，流动注射式发光分析的自动化程度、精密度和准确度都比较高，分析速度快，适用于批量试样的测定荧 光 形 成 机 制单重态第二激发态第一激