建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研究进展

1、1建立全脑缺血再灌 动物模型的实验研 究进展建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研究进展作者：武 钊1,刘佩仪1,文锐玲1,林梓豪1,黎允诗1,黄伟青2,欧阳斌2作者单位：（1.广州医学院检验系，广东 广州 510182;2.广州医学院第一附属医院，广东 广州 510120）【关键词】全脑缺血再灌注动物模型实验研究进展心脏骤停（CA）是急诊医学常见的急症之一，因其居高不下的致死率及致残率给社会和 家庭造成严重威胁，所以心肺脑复苏是现代医学研究的热点课题。心搏骤停是指心跳及呼 吸突然停止，血液循环终止。由于脑细胞对缺氧十分敏感，循环停止 46 min脑组织即可 出现不可逆性损害1。面对突如其来的心脏

2、骤停，目前最有效的治疗方法是心肺复苏。但 是即使复苏后，心脏恢复了搏动，但脑功能的恢复是心肺复苏成功的关键。一般心脏停止 搏动，脑缺血、缺氧立即发生，如超过 46 min就可以出现不可逆的大脑损害。心脏停搏 时间长，如8 min以上，大脑功能很难恢复，成功率极小。有学者研究认为，心脏停搏 后，约50%左右患者死于中枢神经系统损害，即脑死亡。即使心、肺复苏成功，生命保 留，仍约有20%50%左右存在着不同程度的脑功能障碍，成为植物状态（植物人）或痴残等2。在成功进行心月复苏后有 20%40%的患者遗留下永久性神经损害 3。鉴于脑保护和 脑复苏的重要性，近年来对缺血性脑损伤的机制进行了大量的研究，

3、脑是一个血流量大、 代谢旺盛的器官，其功能几乎全靠葡萄糖的氧化代谢。心脏骤停后引起的脑损害的病理生 理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后的大脑缺血再灌注损伤，其中涉及兴奋性 氨基酸的神经毒性、钙离子稳态失调、神经元凋亡等机制4。所以心肺复苏的最终目的是脑复苏。大量研究旨在寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物，并且已经在动物模 型上获得一定成功，但是这些方法和药物很少能成功用于临床。缺血预处理对心脏和神经 系统缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，但是在临床实践中预处理只适用于缺血再灌注 可预期的情况。尽快恢复灌注是减轻缺血导致的损伤和行为障碍的最有效方法，然而再灌 注也可能加重损伤。

4、在再灌注早期，大量活性氧自由基的产生和钙超载导致了缺血再灌注 损伤。所以近年来围绕心肺脑复苏的保护机制及其方法成为专家学者们研究的热门，而建 立有效、稳定的全脑缺血再灌注模型是实验研究的基础。针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有多种，包括：二血管阻断加低血压法、四 血管阻断法、三血管阻断法、颈动脉负压分流法。国内文献报道用四血管阻断法比较多 5,国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均有应用及报道，但更偏向于后者6。对比不同建模方法在实验过程中所显露出的特性，分析并总结各自的优缺点。选择能较好地 建立大鼠全脑缺血再灌注模型的方法，为脑复苏的深入研究提供良好的实验基础。本文将 从实验的可操作性

5、、成功率、发展前景等方面对各类建模方法进行综述。1制作全脑缺血再灌注动物模型及效果的判定全脑缺血再灌注模型模拟心搏骤停在心肺复苏过程中，脑损害的病理生理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后 的大脑缺血再灌注损伤，其中涉及兴奋性氨基酸的神经毒性、钙离子稳态失调、神经元凋 亡等机制4。心脏停搏引起完全性全脑缺血，急性缺血缺氧可造成细胞损伤，恢复血循环 后又可引起再灌注损伤。因此全脑缺血再灌注造成的结构破坏和功能障碍是脑复苏的重要 病理生理过程。目前主要是通过全脑缺血再灌注模型来模拟心搏骤停，即将头部的主要动 脉进行阻断，从而导致全脑缺血，营造出脑组织缺血缺氧的状况。全脑缺血再灌注动物模型要求手

6、术操作简便，致死率低，重复性好；缺血效果好，急、慢性缺血实验均可应用；再灌注方便、完全、充分；尽量能够保持颅脑的完整性；血液的流变性变化尽量要小7。二血管阻断加低血压法建立大鼠全脑缺血再灌注模型采用二血管阻断加低血压建立大鼠全脑缺血再灌注模型：10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，分离暴露右侧股动脉，行股动脉插管，接 BL-420生物机能记录系统监测动 脉血压。颈正中切口，分离双侧颈总动脉及作侧颈静脉，经左侧颈静脉插管，建立给药途 径，静脉注射肝素 150 IU/kg 。经左颈静脉回抽血液，当平均动脉压达 3540 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）时，用微型动脉夹夹

7、闭双侧颈总动脉，此为缺血期开始。期间经颈静 脉回抽放血或静脉注射回输血液保持平均动脉压在3540 mm Hg 。 15 min缺血期后移去微型动脉夹，去除双侧颈总动脉的夹闭，回输血液，此为再灌注期。Pulsinelli四血管法及改良的四血管法建立大鼠全脑缺血再灌注模型四血管阻断法8,9主要是在颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，套线备用。同时枕部 切口（颈部前倾30。，利于手术部位的暴露），借助手术显微镜分离暴露第一颈椎横突翼并找 左右横突孔（椎动脉在人脑前从此孔下通过），将灼热的电烙铁尖头（直径0.5 mm）直接插入翼突孔，深度以23 mm为宜，电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞10。也可采用钻透第

8、一颈椎小孔的方法（即改良的四血管闭塞法），在直视下直接烧灼双侧椎动脉，成功率几乎 100% o 24 h后用乙醛浅麻醉大鼠（也可在清醒状况下手术），颈部常规消毒，打开颈前正中 切口，将套在双侧颈总动脉下的备用线结扎，根据实验需求可阻断血液流动1060 min ,松开结扎线后可实行再灌注研究 11。三血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注模型采用三血管阻断法12建立全脑缺血再灌注模型：20%乌拉坦1 000 mg/kg腹腔麻醉，经颈正中切口，分离双侧颈总动脉备用，剪去枕骨腹侧面部分颅骨，用5-0丝线结扎延髓腹侧面上的基底动脉，通过双侧颈总动脉的关闭和开放实现全脑缺血再灌流。颈动脉负压分流法制作大鼠全脑

9、缺血再灌注模型颈动脉负压分流法13,14制模：采用水合氯醛腹腔麻醉 （350 mg/kg）,取颈部正中切 口，分离左右颈总动脉及右颈外动脉；另取左侧腹股沟部切口，分离左股静脉并置管与输液器相连，从左股静脉注入肝素（180 U）后缓慢注入生理盐水；用微动脉夹夹闭两侧颈总动脉，从右颈外动脉向近心端插入套管针至颈内动脉与颈外动脉的分叉处，取出针芯，套管 接三通与注射器相连，持续抽吸颈总动脉内血液，此为脑缺血开始，抽血速度平均为0.3mL/min左右，由于大鼠在侧支循环及循环血量上的个体差异，控制抽血速度的负压以维持 在使被抽血侧的颈总动脉在直视下处于塌陷状态为宜。在抽血的同时，间断更换注射器， 将抽

10、出的血液从左股静脉持续回输，注意保持抽血速度与输入速度相等。持续抽血30 min后停止抽吸血液，拔出套管并结扎颈外动脉，去除两侧颈总动脉上的微动脉夹，此为再灌 注开始。全脑缺血再灌注后开颅取脑组织进行观察将完成缺血再灌注实验的大鼠进行开颅并取其完整的大脑组织，进行形态学观察。主 要观察项如下：大脑组织的整体形态、脑沟脑回是否清晰、皮质的颜色、浅表血管的状态 及血管内的血流情况。在此基础上经苏木精-伊红染色（HE）,在光镜下观察海马组织及顶叶皮质，主要观察神经元细胞的形态及排列情况、胞质的状态、细胞核的形状及核仁；光镜下观察海马区神经元细胞密度。实验大鼠与正常大鼠脑组织对比正常大鼠大脑无肿胀，脑

11、沟脑回清晰，皮质颜色较红润；浅表血管丰富，充盈好，鲜红。实验组大脑肿胀明显，脑沟脑回变浅，皮质颜色苍白；表面血管塌陷，血流少，部分基本无血流。经HE染色后在光镜下观察海马组织及顶叶皮质，正常大鼠神经元细胞排列规 则，胞质丰富，核呈圆形，核仁清楚；实验大鼠病理改变明显，可见大量神经元坏死变性，排列紊乱，神经元胞质浓缩，胞核固缩，核仁不清；光镜下观察海马区神经元细胞密度实验组比正常对照组低15。2 选择适当可行的方法建立全脑缺血再灌注模型建立全脑缺血再灌注模型的方法脑复苏中存在全脑缺血再灌注损伤，而对脑缺血再灌注损伤的研究仍然是急诊医学中 的重点，脑缺血再灌注模型的制作则是研究工作的重要环节。全脑

12、缺血再灌注模型制作方 法有很多种：四血管阻断法，二血管阻断加低血压法，三血管阻断法，颈动脉负压分流 法。国内文献报道用四血管阻断法比较多，国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均 有应用及报道，但更偏向于后者。简述各种建模方法的特点二血管阻断加低血压法优点：操作简便，用一次性手术即可完成，阻断完全可逆，可人为控制动物呼吸；可模拟临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞合并血液低灌流引起的脑循环障碍， 造成不同程度的脑组织缺血损伤，对于探讨人类缺血性脑损伤的发病规律，评价抗脑缺血 药物的疗效等有价值；成模效率较典型、稳定，可重复性好。缺点：模型不能在清醒动物上复制，无法研究血管狭窄后行为学的

13、变化；常因存在侧支循环而造成缺血不完全，部位不确定；脑缺血时限长，有时导致脑缺血后抽搐、癫病等并发症的发生，且又处于低血压状态，会干扰其他器官、组织的供血和实验结果。四血管阻断法优点：缺血完全，具有较强的可复制性；检验缺血是否成功的指标明确。缺点：手术复杂，缺血的稳定性和成功率较差；个体差异大，术后存活率较低 ；被烧灼阻断的椎动脉不可再通，改变了正常的解剖结构，影响再灌注的脑血流量，造成再灌注不 完全16,17。三血管阻断法优点：成功率高，缺血指标的观察明确简单；可根据实验需要，通过阻断 CCA时间的长短控制脑缺血的程度。缺点：手术难度较大，对实验者的要求较高，故可行性不高；在手术过程中对周围

14、组织牵拉严重，在恢复血流时会受影响。颈动脉负压分流法优点：不改变脑血管的主要解剖结构，不影响基底动脉和椎动脉的血流，脑干无明显 缺血；实施再灌注后，不改变血流动力学方向，仍保持原来的生理状态。缺点：实验的操作较为复杂，很难保证其成功率。结论四血管阻断法由于个体差异大、成功率低并且在手术过程中翼突孔的区分是完全阻断 双侧椎动脉的关键，在翼突孔前上方有一小切口，若肌肉分离不完全，易将该切口误以为 翼突孔，若在此次灼烧，不但不能完全阻断双侧椎动脉，而且还易烧伤脊髓，甚至脑干， 引起动物的立即死亡。三血管阻断法因其操作的复杂性和较高的手术难度，对实验的成功 率有较大影响，使该方法的动物致死率相对有所增

15、高。三血管和四血管阻断法均是通过较 强有力的人为作用使血管血流阻断，骤然改变了正常的生理状况，造成了阻断的动脉血管 内压力的改变，引起一系列应激性生理及病理反射，增加了脑缺血因素的复杂性。对于颈 动脉负压分流法，Bannister和Chapman18认为这种脑缺血主要是右侧大脑中动脉供应 的区域缺血；然而一些学者经实验研究发现，造成这一差异的原因，可能与放血速度、颈 内动脉压力降低程度以及动物种属差异等因素有关。所以此方法在实验过程中受较多不确 定的因素影响，故不 被广泛采用。二血管阻断法在可行性及成功率上具有显著的优势，就 达到全脑缺血状态而言，此方法完全可以满足实验的要求，并且按照血流动力

16、学观点来分析，二血管阻断加低血压 法更符合血流动力学的要求。采用较为柔和的人为作用，在造成 脑缺血的同时，维持了全部或部分两系血管的开放，基本保证了血液在脑部流动的方向性，能较好地建立大鼠全脑缺血再灌注模型，可为脑复苏的深入研究提供良好实验基础。3二血管阻断加低血压法在建立大鼠全脑缺血再灌注模型的评述及展望由于心脏紧急救治和心肺复苏(CPR)国际指南在我国的普及推广，越来越多的CA患者经基础复苏恢复了自主循环，但脑复苏成功率仍较低。如何加强以脑复苏为重点的后 期复苏阶段的处理，提高脑复苏成功率，是国内外医学界近年来研究的热门课题。虽然目 前的研究已经取得了阶段性成果，但是仅仅只是在动物模型上获

17、得一定的成功，要运用到 临床实践中还有待进一步的研究探索，这也注定了心肺脑复苏将在未来的一定时期内保持 着较高的研究热度和新鲜性。而作为该项研究的基础，如何建立典型的、稳定的动物模型 将成为影响其实验结果的重要因素之一。本文从建立大鼠全脑缺血再灌注模型的众多方法中，挑选出二血管阻断加低血压法与 四血管阻断法两种采用最多的方法进行研究分析。总结如下：国内文献报道用四血管阻断 法比较多5,国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均有应用及报道，但更偏向于后 者6。通过分析对比两者的操作性与成功率，可以得出二血管阻断加低血压法在建立大鼠 全脑缺血再灌注模型中有较大的优越性和可行性。与此同时在中西方文化

18、密切交流的环境 中，西方被广泛应用的技术一定会随着双边文化的交流引入并推广到中国。综上所述，二 血管阻断加低血压法将凭借其较强的可行性与较高的成功率等优势，在建立大鼠全脑缺血 再灌注模型中得到进一步的推广和应用，较好地建立大鼠全脑缺血再灌注模型，可为脑复 苏的深入研究提供良好的实验基础。【参考文献】1,郭星君.心肺脑复苏新进展J.实用医药杂志，2010(5): 463-465.2,徐姜定.脑复苏与脑死亡J.浙江临床医学，2008(7) : 865-866.3,孙亚新，徐岩，韩秀文.心肺复苏后中枢神经功能障碍与急性胃黏膜病变的关系J.世界华人消化杂志，2005,13(3) : 424-425.4

19、,Hidenori E , Hiroshi K , Chikako N , et al.Mitochondrial translocation of p53 mediates release of cytochrome c and hippocampal CA1 neuronal death after transient global cerebral ischemia in ratsJ.J Neurosci,2006,26(30): 7 974-7 983.5,欧册华，王晓斌.兔全脑缺血动物模型复制方法的改进J.四川动物，2002(2) : 4546.6,Zhang J H , Qian

20、H , Sun H S.Rapid hypoxia preconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicity throughdelta-opioid receptorJ.Stroke,2006,37(4): 1094-1 099.7,Brolongan C V , Wang Y , Su T P.Delta opioid peptide(D-Ala 2, D-Leu 5)enkephalin : linking hibernation and neuroprotection.J.Front Biosc i,2004,1(9): 3 392-3398.8,李文东，姜洪波，连晓清，等 .Pulsinelli四血管法大鼠全脑缺血模型制作方法的改 进J.新乡医学院学报，2010,27(3) : 237-239.9,李兵，章翔.改良四血管阻塞法建立大鼠全脑缺血模型J.中华神经外科疾病研究杂志，2005,4(2) : 110-113.10,周光新，高诚，徐平.