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文档简介
1、ContentsIdsIe-availLabeat3c=nceLire.CarbohydratePolymersjournsihoiRA|M00pwww*1ttv14r.ccinn/iC9tfdpo.ayer-by-laycricaredlipid-polymcrhybridnanoparriclesdesignedforuseinanLicaiucrdrugdeliveryThiruganeshHmnisamyJ.TuanHiepTranJuYeonChai1.HyukjunChoJ,JeongHvvanKimChuiSoonYon*Han-GonChoibr*,JongOhKimifrf讣
2、口即1如*加押阳科卓*fiW-HrtnfWiuftffnirJ叮“些屮“jTPTrfc、Jai|:|iS叩尹*p蔣|4:皿乩1(1.JliijfnBw(jftAUIlk,tniftijirr.55-|tfJiJW-UiidLrflMli淞Sui百ijnk驰卅匚型炳刊人用于抗癌载药系统的自组装脂质体聚合物复合微球摘要:通过多种物质的连续吸附得到的聚电解质多分子层对于像抗癌药物这种小分子的运载是非常有用的。在本研究中,层层自组装LbL纳米结构通过以下方法制得:将天然壳聚糖和透明质酸自然沉积到带负电的固态混合脂质体纳米微球SLNs上。阿霉素/葡聚糖硫酸酯的复合物被包在SLNs中。这使得球形纳米微粒的
3、直径在265nm左右,Zeta电位大约为-12mV。纳米微球较为稳定,且表现出阿霉素DOX的可控释放。进一步的药代动力学研究说明,相比单纯的DOX以与未经修饰的载DOX-SLNsLBL功能化SLNs明显提高了循环半衰期,并降低了药物的消除率。综上,结果说明这种具有pH响应外壳和分子靶向性的新型LBL修饰系统,有着作为肿瘤靶向性的药物释放载体的潜质。简介固体脂质纳米粒SLNs因其能够运载亲水和疏水治疗药物的特性而受到广泛关注。SLNs是结合了聚合物胶体和脂质体微粒优点的胶体载体。它们拥有极好的生物相容性,延展性和稳定性,有着高载药率。然而,SLNs的使用总是和突释以与体的过早释放联系在一起,主要
4、是因为微粒总是倾向于结晶,使得药物从核中释放出来。此外,通过网状皮组织RES的活动,SLN基结构会很迅速的从循环中除去。如果想用这类纳米微粒有效的运输抗肿瘤药物,那么通过制备出一种简单定制,经过外表修饰的控释运载系统来克制这些缺点是相当有必要的。一种表现出良好性质的新系统是利用带有相反电荷的聚合物层层自装载LBL形成的多层聚电解质PEM涂层。这种聚电解质自沉积的方法作为功能化微粒外表或制备核-壳结构微粒的新方法。PEM在药物运载领域中可以运用于许多治疗方法中。越来越多的证据说明,LBL结构能够延长血液循环,并且对肿瘤间隙的被动扩散和渗透有促进作用。另外,因为层状材料本身的靶向性质,这些结构的肿
5、瘤靶向能力也得到了提升。这种核-壳微球的另一个关键优点包括粒径,高载药率,可控药物释放,以与也许最重要的,可调节的较长的体血液循环。到现在为止,有关LBL薄膜在载药和体肿瘤区域靶向性的应用的检测的研究还很少。而且,现在还没有研究是有关能否得到带电高分子在载药和混合SLNs上自然沉积的。在本研究中,我们使用LBL技术来制备稳定的核-壳微粒,使我们能够结合SLNs和PEM勺优点。我们设计了三种运载体系:载阿霉素SLNDOX-SLNs,载阿霉素/葡聚糖硫酸盐混合SLNDOX/DS-SLNLBL覆盖DOX/DS-SLNsLBL-DOX/DS-SLNs。天然壳聚糖CS和透明质酸HA作为一对天然可降解生物
6、高分子,有着很好的生物相容性和生物可降解性,可以作为LBL结构中的层状覆盖材料。为了研究载药系统的适宜制备方法,我们评估了理化参数,并进展了体外释放实验,细胞毒性实验和一些药代动力学实验。材料与方法2.1材料22LBL修饰SLNs的制备SLNs用热均一法进展制备。通过对脂质体和外表活性剂电位的分析,我们认为Compriol888ATO,卵磷脂和吐温-80是最适合SLN制备的。简单地说,300mg的Compriol888ATO和30mg卵磷脂在10C下熔化,这个温度高于脂质体的熔点,以保持透明的溶液。水相的外表活性剂是将200卩L的吐温-80溶于10ml蒸馏水中,然后加热到油相的温度。加热的水相
7、参加到油相中并使用Ultra-Turrax?T-25均质机分散均匀13500rpm,3min。得到的粗状乳液使用探头超声仪超声乳化90%振幅,3min。通过冰浴降温热的纳米乳液得到SLNs。DOX-SLNs是通过参加10%w/w的药物在油相中得到的。DOX/DS-SLNs是通过相似的方法制得的,但有些细微的改变。DOX在DS溶液中低速200rpm/min丨搅拌2h孵育。同时将这局部水相加热到60C丨和水相外表活性剂参加油相中。其他的步骤与上段描述的过程一样。DOX/DS复合物分散在SLN核中。为了制备层层自组装DOX/DS-SLNs我们用不同体积比的带正电的CT溶液来包覆带负电的DOX/DS-
8、SLN然后将带负电的HA溶液参加带正电的CT-SLNs,轻微震荡混合物,孵育1h,制得LBL-DOX/DS-SLNs图1bxorubidn(DOX|bxorubidn(DOX|Deictra-nSulfateLipidAuocithIn/SurfjctjntHomagsnifatlcnDOXJDSComplaxi辰DOWS-SLNLipidCaroTLayfrHALayerChitasan-coatedSLNChitosan(CTFij.LhdramillusElatingtheprepjrationprocessforLtL-coated5EAsCQralainingDtWDcornplED
9、Les.2.3粒径,Zeta电位和多分散性的测量我们使用动态光散射法来测定粒径,多分散系数PDI和匸电位。通过使用Nano-S90Sizer,我们在固定衍射角为90。进展测量。用蒸馏水讲SLN分散液进展适当稀释比原浓度小50倍,大约为500卩g/ml,然后再25C测量。水相动力学粒径通过Stokes-Einstein方程确定。Z电位和PDI使用由制造商提供的NanoDTS软件6.34坂本确定。每个样都经过三组测定,每组十次。2.4形态分析不同配方的微球形貌分析是通过投射电子显微镜TEM在100kV加速电压下得到。将一滴SLN滴在有碳膜覆盖的铜网上。当微粒贴附于网上的时候,使用磷钨酸2%w/v进
10、展负染色。铜网置于适当的红外光下进展枯燥,然后再显微镜下成像。2.5物理性质我们使用差示扫描量热法DSC研究样品的热行为。DSC记录是以10C/min的升温速度从40C到250C。实验在流速为50ml/min的流动氮气气氛进展。2.6载药率载药率通过使用离心式超滤装置超滤得到。药物浓度通过标准比色法得到。为了评估被包裹的DOX我们将2mlSLN分布在超滤装置中5000rpm,10min。在收集到滤液后,最终的载药率是由载药SLN在紫外分光仪中482nm下的吸收光度决定的。2.7体外释放实验我们使用透析袋进展透析实验,来确定DOX-SLNsDOX/DS-SLNs和LBL-DOX/DX-SLNs中
11、DOX的释放率。每种样品都放在磷酸盐缓冲液中PBS,pH7.4,0.14MNaCl。实验在37C,100rpm摇速下进展。每隔固定的时间,用新鲜介质来替换缓释介质,以模拟无限槽液环境。透析液中DOX的浓度通过分光光度法确定482nm下的吸光度来决定。从SLNs中的释药量将以总含药量的百分比的形式表示,并描绘成跟时间相关的函数。2.8体外细胞毒性实验纯DOXDOX-SLNsDOX/DS-SLNs的体外细胞毒性实验使用之前报道的MTT法来确定。4简单地说,将1x10MCF-7乳腺癌细胞或A-549非小肺癌细胞种在96孔板上,在37C下孵育24小时。这些表现出对CD44受体中等承受的细胞,将暴露在不
12、同浓度的DOX和DOX-SLNs下,并在37C下孵育24小时。然后将细胞用PBS洗涤两次,然后置于含10%牛胎儿血清FBS的DMEM溶液中再孵育72小时。再在每个孔中参加100卩LMTT1.25mg/ml,将样品置于黑暗中,37C反响3小时。随后细胞溶解,参加100卩LDMSO溶液甲腊晶体。最后,我们使用酶标仪来测定570nm波长下的吸光度,每个样本测定8次。细胞活性如下计算:Aample/Aconrtol*100%,其中A为570nm下的吸光度。2.9药代动力学实验研究协议重约24010g的雄性大鼠被分为四组,每组三只。大鼠在202C和50-60%RH下检疫生存,实验周期加快到12小时。此协
13、议由国岭南大学动物伦理委员会通过。给药和血液收集我们在每只大鼠的右股动脉进展插管,在既定间隔下0.25,0.5,1,2,4,6,8,10,12和24小时抽取血液样本0.25ml,同时在左股静脉进展插管,进展纯DOX溶液,DOX-SLNs,DOX/DS-SLNs或LBL-DOX/DS-SLNs的给药。外科创口立刻在外科缝合线的帮助下进展缝合,用以减轻大鼠疼痛,并延长试验周期。血液被取出后,立刻在13000rpm转速下离心别离十分钟,别离萃取出血清进展进一步研究。高效液相色谱法HPLC血清样本的制备为了从血清样本中沉淀出蛋白质,我们将150卩L的血清和150卩L的乙腈搅拌混合30min。上清液在1
14、3000rpm转速下离心10min别离,然后样品在真空枯燥箱中40C挥发。剩余物再参加到乙腈中混合,离心别离。为了量化每份血清样本中的药物水平,我们将20卩L的上清液参加含有一个泵,一个自动采样器和一个连有Ci8检测的紫外检测器的HPLC系统。移动相组成为甲醇:水:醋酸50:49:1,pH2.9,流速为1.2ml/min。流出物通过在280nm下紫外吸收强度进展检测。药代动力学数据和统计数据分析略结果与讨论3.1层层自组装混合SLN的制备聚电解质直接装配在SLN上,得到层层自组装混合SLN从众多的带电聚合物中,我们选取了带正电的天然壳聚糖CS和带负电的透明质酸HA作为一对组装物。这些多功能多糖
15、表现出极好的生物相容性和拒水拒油抗污性能,后者可以防止血液中不必要的蛋白质吸收和调理作用。另外,HA可以作为肿瘤细胞中CD44的超量表达的靶向目标。由于PEM沉积物主要由静电作用力,离子强度和电荷强度决定,弱电解质聚合物的结构就至关重要,反过来也会影响pH。因此,我们通过分别调节CSpKa为6.6丨和HApKaSLNs外表的负电荷促进了PEM的可选择性。SLNs首先是通过均一法,在脂质体的熔点之上制备,以保持溶液透明。带负电的SLNs包覆上不同体积比的带正电的CS虽然在几乎每种CS溶液的装配过程之后微粒的粒径都增长了,但在最后一个条件下微粒粒径减小额30卩L,图2A。而且,CS溶液于电位的稳定
16、转变联系在一起,从-37mV到+35mV图2B。最后两个条件下极小的电位差异说明外表修饰应该在更高的浓度下完成。当CS首先参加到带负电的脂质体微粒中时,静电作用力带来了强相互作用。这使得微粒外表形成聚合物团聚,并随着聚合物的增加而增大尺寸。而此时CS的参加使得微粒外表电位得到中和。但是,在中和或拐点之后,后续聚合物的参加会导致外表电位的强烈反转,产生稳定且更坚硬的更小尺寸的微粒。在最适浓度下,CS会在微粒的外表形成像制服一样的薄层。随后,后续参加的更多的CS会增大微粒的尺寸。第二层多阴离子的HA溶液的参加使得微粒尺寸到达大约300nm,尽管最终尺寸为230nm左右图2C。由于第二层的沉积带来的
17、厚度上增加的10nm是值得注意的。这个与之前报道的相符,即弱电解质聚合物,如HA,会在前一层沉积层上因为聚合物的扩散作用而呈指数增长。事实上,CS-HA层的增长据我们所知是发生在光滑外表上的。而且,与其他由于电荷的过度补偿而直线增长的其他聚合物组合相比,HA形成了松软的非刚性薄膜。这个行为也解释了由于强静电相互作用,短HA链在长CS链间更易扩散。综上,双沉积层增加了微粒50nm的厚度从沉积之前的175nm到最后的225nm。我们同样在整个参加层后观察到较好的均一分散性PDI约为0.2。随着不同聚合物交替沉积,微球外表的电荷也在交替变换,这证实了膜层在静电作用力的驱动下层状覆盖。因此,我们证明最
18、终LBL-SLNs外表的电荷可以根据我们的需要进展适当的调配。另外,HA作为最外层,既可以提供靶向性,也可以作为控释释放的一层材料。这种技术的成功说明,为了通过EPR效应,生产适宜尺寸的LBL生物药物载体微囊来运输抗癌药物是可行的的。如酸S10II込30(0)RfiiLKkjcaMMFig乙uirKcmzinnar呃M乩划q血畫情炖酬1逊育bjiia-up_ureaarimiUKequenideposiiBanMcittern(U)jndlurorb:aodi.HA)g(Aw*itiraiarric血柑ndpo$di攣用iiKlex.and(11处end魂卜囚“茴CimirjliOTS(tf51Mi,Cr.and昭wrfInng/:mLiniulwasImL3.2DOX的负载DOX-SLNs和DOX/DS-SLNs是通过在液体混合物中参加10%w/w的药物制备而成的。在药物参加SLN核后,DOX-SLNs和DOX/DS-SLNs在尺寸方面都没有明显的变化。这可能是因
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