竞争放射分析放射免疫分析课件

1、竞争放射分析放射免疫分析 （Radio Immuno Assay, RIA）竞争性蛋白结合分析 （Competitive Protein Binding Assay, CPBA）放射受体分析 （Radio Receptor Assay, RRA）优点： 1、灵敏度高 3、应用范围广 2、特异性强 4、操作简单缺点： 1、生物试剂，稳定性受多因素影响 2、灵敏度难以超过ag水平竞争放射分析的原理*P + Q =（*PQ）+*P + P = （PQ）+P *P ：标记物 P ：未标记物 Q ： 特异性结合剂放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab = （*AgAb）+（AgAb）+*Ag + Ag 0

2、Max Min 条件：1、 *Ag定量、足量 2、 Ab限量 *AgAb 专用符号： 1、T 加入的*Ag的放射性计数 2、B *AgAb免疫复合物的放射性计数 3、B0 Ag=0时*AgAb放射性计数 4、F 游离的*Ag的放射性计数 T=B+F 5、NSB 非特异性结合产生的放射性计数 6、结合率：B/T、B/B0、B/F竞争放射分析的三种基本试剂标准品标记物特异性结合剂标 准 品化学结构： 应与被测物具有相同的化学结构化学纯度： 纯品化学度量： 准确稳定性： 保持生物活性不变标 记 物要求： 1、较高的比活度 2、生物活性与免疫活性：与标记前一致 3、放射化学纯度：95% 4、稳定性鉴定

3、： 1、最大结合率 2、标准曲线比较法 3、稀释曲线比较法特异性结合剂要求： 1、亲和力 2、高滴度 3、特异性 4、可长期保存抗 血 清抗原动物选择佐剂免疫动物、收获鉴定抗体抗血清的鉴定亲和力： 指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。特异性： 抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用 交叉反应率（Cross Reaction）表示 交叉反应率=Y/Z100% Y：标准抗原取代50%结合率所对应的浓度 Z：类似物取代50%结合率所对应的浓度 交叉反应率测定：以比正常生理浓度高100倍以上的类似物为测定物进行测定，同时观察置换0标准管50时所对应的化学量滴度： 结合5

4、0%标记抗原时血清的稀释度单 克 隆 抗 体特点： 特异性高 抗体成分专一 可反复制备制备： 1、免疫小鼠，制备脾细 胞悬液 2、选择培养，用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞 3、检测抗体 4、克隆化其它特异性结合剂血浆结合球蛋白受体蛋白放射性标记T4与不同特异性结合剂结合与游离部分的分离分离方法的要求 1、使结合部分与游离部分尽可能完全 分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、试剂来源广泛、价廉易得常用的分离方法双抗体法聚乙二聚法（PEG）活性炭吸附法盐析法微孔滤膜法SPA法固相抗体法：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球磁化

5、颗粒法屏蔽计数法竞争放射分析方法的建立反 应 方 式平衡法顺序加样法STAT法试 剂 用 量高含量样品： 灵敏度高，B0/T在3050%低含量样品： 高剂量斜率好，B0/T在5070%反 应 介 质pH和离子强度反应体积添加剂样品处理加 样 程 序实验设计、配制试剂加未标记物（标准品或待测样品）加标记物加特异性结合剂混匀、温育加分离剂、分离B与F测量各管放射性计数，绘制标准曲线由标准曲线反求出样品浓度免 疫 放 射 分 析（Immunoradiometric Assay,IRMA）IRMA的基本原理单位点系统： Ag + *Ab (Ag-*Ab) + *Ab ImAd-Ag + *Ab ImA

6、d-Ag-*AbIRMA与RIA的主要区别IRMA的实验方法单位点系统双位点系统标记第三抗体法双标记抗体法IRMA的特点标记物的放射性活度高反应达到平衡快比RIA更高的灵敏度比RIA的标准曲线范围更宽比RIA的特异性更高方法稳定性好目前仅能检测大抗原数 据 处 理作图法数学模型计算法几种数学模型线性内插多项式函数样条函数直线化模型Logistic模型四参数标准曲线应符合的条件B1/B085%，Bn/B03标准曲线的质控参数B0%：3070% ，50%最佳NSB/T5%，NSB/B00.99质 量 控 制近期目的： 通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍远

7、期目的： 通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量误差及引起误差的原因试剂加样误差分离误差测量误差数据处理样品的采集与制备质量控制指标精 密 度用同一实验方法多次检测同一样品所得结果的一致程度和重复性标准差、变异系数、效应误差关系、精密度图准 确 度测定值与真值的符合程度用回收试验及平行实验来评价灵 敏 度测定方法的最小可测量确定方法： 零标准管法、t值检验法、 粗略估计法特 异 性特异性决定于抗体常用交叉反应率表示稳 定 性指批间的重复性常用指标： B0%、NSB、ED、r等临床有效性与临床的符合程度真阳性率、真阴性率、假阳性率、真阴性率内 部 质 控批内质控： 批间质控：外 部 质 控目的： 提高各实验室之间检测结果的可比性方法： 由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用以促进检测质量的提高和资料的可比性。体外放射分析的误差室内质控室间质控批内质控批间质控批内精密度与偏听偏信倚分析批间精密度与偏听偏信倚分析寻找误差产生的原因、改进分析工