细胞工程第四章植物组织器官培养技术课件

1、第四章 植物组织器官培养技术 知识目标：掌握植物组织培养的基本概念和基本原理理解植物细胞脱分化与再分化现象掌握植物组织培养的基本程序。掌握植物脱毒与快速繁殖、花药和花粉培养、植物胚胎培养和人工种子等技术。1植物组织培养概念 由植物组织或器官培养产生愈伤组织，进而培养成完整植株。人工培养植物体一部分(即外植体 ) 生成完整植株。 第一节 植物组织培养的基本原理 一、植物组织培养的相关定义广义和狭义概念有何区别？组培范围不同，即外植体范围不同。 2外植体explant：从植物体分离并用于离体培养的材料。.愈伤组织在离体培养时形成的具分生能力的一 团不规则细胞，多在外植体切面上产生。.初代培养：芽、

2、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。.继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。 .生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。 .驯化移栽： 组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应 露地或保护地条件的过程。 .胚状体embroid： 在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。 石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程 二、植物组织培养的基本原理(一)植物细胞全能性 每一个植物细胞带有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不

3、同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。 参照动物细胞研究分类类型，植物细胞也可分为三类 第一类是茎尖、根尖及形成层细胞，这类细胞始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期，为周期细胞。 第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞，他们为永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞。 第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞，这类细胞在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂，称为Go细胞。 （二）实现植物细胞全能性的条件 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。(三)植物细胞分化 细胞分化（differentiation），是指导致细胞形成不同

4、结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 分化是指植物体各个部分出现异质性的现象，可以在细胞水平、组织水平或器官水平上表现出来 脱分化细胞分裂再分化个体再生细胞全能性 细胞全能性的表达是通过脱分化和在分化实现的，在大多数情况下，脱分化是全能性表达的前提，再分化是全能性表达的最终体现 脱分化也称去分化，是指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成方未分化细胞特性的细胞的过程。 愈伤组织 再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。（1）培养的植物细胞或组

5、织的脱分化，形成愈伤组织。（2）由新形成的愈伤组织形成一些分生细胞，随后由其分化成不同的器官原基。（1）器官发生方式：先芽后根先根后芽根芽同步发生（四）离体培养中再生植株的两条途径脱分化再分化（2）体细胞胚胎发生 离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体 (一)植物体细胞胚胎发生过程1体细胞胚从外植体上直接发生 诱导阶段胚胎发育阶段2经过愈伤组织的体细胞胚发生 诱导愈伤组织形成愈伤组织胚性化球形胚期子叶胚期综上所述，植物细胞组织培养的全过程可以简单描述如下 体细胞胚和不定器官再分化完整植株外植体（细胞）愈伤

6、组织脱分化一、无菌外植体的获得0.10.2 氯化汞（210分钟）70 酒精数秒，转入10 氯化钙（210分钟）或者转入2 次氯酸钠（1530分钟） 消毒流程第二节 植物组织培养的基本步骤二 、初代培养物的建立无菌环境规范操作条件合适三 、形态发生和植株再生四 培养产物的观察记载愈伤组织胚状体芽根第三节 植物脱毒与快速繁殖一、植物脱毒和快速繁殖的意义1能够有效保持优良品种特性 离体无性繁殖主要是以植物营养器官为外植体，繁殖过程在人工控制的环境条件下，所以既不会造成性状分离，同时还避免了病虫害的浸染，从而可以很好地保持品种的优良特性。 2生产无病毒种苗，防止品种退化 唐菖蒲病毒病 辣椒病毒病 3快

7、速繁殖新品种，加速优良品种推广 离体繁殖因为周期短(13个月)，不受季节限制，因此繁殖系数高（几十至几百倍），其繁殖速度是任何其它方法所不能比拟的，所以通常将组织培养繁殖称之为快繁(rapid clonal propagation)。这就大大地加快了优良品种的推广速度 。4节约耕地，提高农产品商品产出率 对于那些以块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物来讲，每年相当一部分产品要用作留种。如： 大蒜 留种量占产量的1/51/8。 马铃薯 留种量占产量的1/10。 贝母 留种量占产量的1/3。二、植物脱毒的原理和技术（一）热处理脱毒（温热疗法）1.原理：当植物组织处于高于正常温度的环境（35-40）时，

8、组织内部的病毒部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。思考：热处理的作用是什么？2.热处理方法： 温汤（浸渍）处理：适用于离体材料（如接穗）和休眠器官的处理。在50 左右的温水中浸渍10min至数小时，使病毒失活。热风（热空气）处理 恒温处理：将生长的盆栽植物移入温热疗室内，一般在3540 。对活跃生长的茎尖效果较好，处理时间因植物而异。变温处理：如马铃薯每天40 处理4h，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持芽眼的活力。 缺陷：不能脱除所有病毒。例如在马铃薯中只能消除卷叶病毒。 注：热处理需与其它方法配合应用(二)茎尖培养脱毒1.茎尖培养脱毒原理 染病植株体内病毒的分布不均匀，

9、越靠近茎顶的感染深度越低，生长点（约0.11.0mm）几乎不含或含病毒很少。 原因:无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，不及细胞不断分裂和生长的速度。因此可利用微茎尖培养脱毒。 茎尖大小与脱毒效果。茎尖培养的脱毒效果与茎尖大小呈反比;茎尖培养的成活率与茎尖大小呈正比。思考：什么样的茎尖大小合适？带1-3个叶原基的茎尖（0.3-0.5mm）作为外植体。材料选择、消毒 微茎尖的剥取 接种2.茎尖培养方法材料选择、消毒： 在植株上直接取或在室内培养一段时间的植株上取顶芽或侧芽然后消毒（或不消毒）。 微茎尖的剥取： 解剖镜下剥取。注意勿损伤生长点。接种：随剥随接，尽快接种。 培养：22左右，每天以16

10、h、15005000lx光照下培养。保证较高温度和充足光照时间。继代、生根培养：同器官培养。3.培养基与培养方式常用培养基： MS White、Morel 适当提高生长素（0.10.5mg/L）与细胞分裂素浓度。有时可加活性炭。用NAA或IBA，Kt或BA， 不用2,4D。 GA适当。4.影响微茎尖培养的因素外植体大小： 通常以带1-3个幼叶原基的茎尖（约0.3-0.5mm)作外植体为宜。不同植物脱毒适宜的茎尖大小不同。 培养条件：增加光照 外植体的生理状态 茎尖最好在活跃生长的芽上切取， 取芽的时间最好是在萌动期较好。三、离体繁殖 离体繁殖(propagation in vitro)是在人工

11、控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。目前已有近400种植物的离体繁殖已获得成功，其中许多具有重要经济价值的花卉(如兰花、菊花、石竹等)、水果(如草莓、无籽西瓜、葡萄、草莓和香蕉等)、经济作物(如马铃薯、甘蔗等)和林木(如桉树、杨树等)等，均已建立离体繁殖的种苗生产体系，取得了巨大的经济效益和社会效益。 （一）离体繁殖的一般技术1.外植体的选择(1)根据培养目的选择(2)考虑种质、取材大小、时期和材料的生理状态，具有代表性植物在自然条件下的繁殖特点 离体条件下茎芽的增殖方式 外植体的取材部位、大小和生理状态。 2培养物的增殖 植物的种类和自然生长习性不同，其增殖方式及所采取的相应技

12、术措施也不一样。一般来讲，培养物的增殖有以下4种方式 芽增殖特点主要表现在培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。目前采用这一方式快速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄和月季等。 不定芽增殖 从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。特点主要表现在繁殖系数高，有较好的遗传稳定性。 胚状体增殖 特点是增长率高，胚的双极性免去了生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。因此，目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一技术途径还没有用于植物的快速繁殖。 愈伤组织增殖 可以说，所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导形成愈伤组织,愈伤组织再

13、进一步分化即可获得小植株。愈伤组织增殖的特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。 3生根培养 4生产用苗的培植 （二）离体繁殖的使用范围离体繁殖常用于以下几个方面：某些难以繁殖或繁殖系数很低的植物某些需要加速繁殖的特殊基因型如名贵花卉、优良资源、果树芽变体和转基因植株等自然无性繁殖极易感染病毒的植物如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物 （三）离体繁殖的遗传变异与控制1外源生长调节剂对品种典型性的影响2继代次数与变异3增殖方式的合理选择第四节 花药及花粉培养一、基本概念与意义花药培养指应用组织培养技术，将花粉发育至一定阶段的花药接种到

14、人工培养基上进行培养，以诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的技术。花粉培养则需将花粉从花药中游离出来，再进行离体培养 花药及花粉培养1克服后代分离，缩短育种年限2选择效率高3有利于隐性基因控制性状的选择4快速获得自交系的超雄株5其他二、花药培养技术 1 .花药培养实质： 器官培养2.花药培养程序 材料预处理： 低温冷藏、60钴照射、乙烯利喷母株，提高出愈 率。表面灭菌： 70%酒精表面擦洗或按器官灭菌方法。接种： 接种程序见图。注：不要直接夹花药；接种密度宜高。3.形成途径4.花药材料的选择 思考：花粉发育四个时期？ （1）花药培养适宜的花粉发育时期：大多数植物单核期

15、，尤其是单核中、晚期。花粉发育时期的检测方法：压片染色法：采用醋酸洋红或KI染色法。花器官形态特点观察 （2）花药材料的基因型、生理状况 （即植物种类、品种、母株年 龄、营养状况） 5.培养基的选择（1）基本培养基：MS、N6、B5等 注：铵盐浓度高抑制花粉愈伤组织的形成。 （2）激素：6-BAKT、ZT，2,4-D、NAA、IAA 愈伤组织诱导：基本培养基+2,4-D 1-3 分化培养基：基本培养基+ 6-BA 2-3+IAA0.2 -0.5 生根培养基：生长素 0.5-1或不加。（3）蔗糖：浓度对花粉愈伤组织诱导率有影响，多数为2-4%。诱导愈伤组织用高浓度，而愈伤组织分化成苗用较低浓度。

16、 （4）活性炭：促进胚状体发育，提高花粉质量。 （5）有机附加物：添加有机物效果好。三、花粉培养技术1.花粉分离 自然散粉法 机械挤压梯度离心法2.花粉预处理 低温处理：花粉第1次有丝分裂期处理离体的花蕾效果好。 离心（靠重力作用）：在花蕾中取出花药前1h，5下离心可提高单倍体植株的诱导率(如烟草、玉米)。3.培养基以尼许(Nitsch)培养基为基本培养基.4.花粉培养方法1.微室培养法 2.看护培养法 3.平板培养4.液体培养5.双层培养微室培养法将含有花粉(50-80粒)的培养液低温(4)接种于微室培养装置中，20 下培养。看护培养法 3.平板培养4.液体培养5.双层培养(三)单倍体植株的

17、染色体加倍 单倍体植株的鉴定A.直接鉴定;B.间接鉴定单倍体植株的加倍A.自然加倍;B.人工加倍;C.创伤法加倍第五节 植物胚胎培养胚胎培养：指对植物的胚，子房，胚珠，胚乳进行离体培养，使其发育成完整植物的技术根据培养中所取外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养一、胚培养1.优点： 克服杂交育种中杂种胚的早期夭折克服珠心胚干扰，提高育种效率打破种子休眠，提高育种效率提高种子 萌发率2.成熟胚培养 A.种子表面消毒后，在无菌条件下剥离出胚，接种于MS或MS+生长激素+(GA) B.培养基：MS+糖(1-2%)+生长辅助物质(激素、AA、活性炭、维生素等)3.幼胚培

18、养 A.种子表面消毒后，在无菌条件和高倍解剖镜下切取完整胚，然后接种。 B.培养基：MS B5 Nitsch 无机盐+糖(3-5%)+生长辅助物质(维生素、AA、椰乳等) C.发育方式胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。 愈伤组织(callus) 在许多情

19、况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。4.影响因素：A.pH值在5.2-6.3，与植物有关。 B.温度：多数胚25，有的需变温或较低较高温度。 C.光照：通常弱光培养。光暗交替对幼胚生长有利，光照不利于胚根生长。D.幼胚需高无机盐、高AA、高蔗糖、高渗透压。 E.液体培养基利于幼胚培养，固体培养基利于成熟胚培养二、胚珠培养1.胚珠培养：将胚珠从母体上分离出来，在人工控制的条件下进行离体培养的，使其生长发育形成幼苗的技术。2.胚株培养在实际中的应用受精的胚珠:打破种子休眠;挽救胚的发育未受精的胚珠:获得单倍体植株3.培养 取材灭菌接种4.胚珠的发育途径三、子房培养及其应用 1.意

20、义诱变发生单倍体植株杂种植株的获得为试管受精提供基础技术2.摘取时间：在开花前15天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。 3.灭菌：禾谷类用70%酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌15分；一般植物的花蕾用70%酒精浸30秒，0.1%升汞1520分。无菌水冲洗，无菌滤纸吸干。4.接种： 无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、N6等）。 5.培养： T26,RH50-60%，16h散射光。四、胚乳培养及其应用(自学)(一)培养过程(二)培养基与培养条件(三)再生植株的染色体倍数(四)胚乳培养的应用第六节 人工种子一、人工种子的概念 人工种子又称合成种子或体细胞种子。任何一种繁殖

21、体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。马铃薯人工种子 根据包被的需要程度可分为三类 裸露的或休眠的繁殖体 人工种皮包被的繁殖体 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 二、繁殖体的类型及其生产(一)不同类型繁殖体比较体细胞胚：诱导和形成需要经过至少两个阶段：第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，诱导培养胚性细胞；第二阶段，在较低生长素或无生长素的培养基中形成体细胞胚微芽：一般只需一个培养程序，但有时为了增加繁殖体的数量，也需进行一定次数的继代。 微型变态器官：需要经过不同的诱导程序。 (二)繁殖体的生产1体细胞胚的规模化生产对于作为人工种子繁

22、殖体的体细胞胚而言，基本要求是具有发育上的一致性。 此外还具有如下的特点：形态正常，具有完整的胚结构；与母体植物的基因型基本相同；具有教好的成熟性，能耐一定程度的脱水2微型营养变态器官繁殖体的培养许多能够产生块茎、鳞茎、球茎等器官的植物，其营养变态器官通常又是这些植物的繁殖器官。离体培养条件下，这些变态器官亦可以通过一定的控制条件诱导产生 。 3芽繁殖体的培养 大多数情况下，微芽、不定芽的培养往往直接从外植体上直接诱导形成，培养方式简单，且勿需高浓度的激素处理，因此，所产生的繁殖体能保持原有植物的品种特性。 三、人工种子包被完整的人工种子应该由3个部分组成：繁殖体、人工胚乳和人工种皮。 人工种子包被的制作主要经过繁殖体预处理、包埋和种皮包被等环节。 (一)繁殖体的预处理体细胞胚适度脱水干燥和强制休眠； 微型变态器官繁殖体表面消毒处理；芽为繁殖体的老化处理。(二)繁殖体的包埋几种植物人工种子的附加成分及成苗率。海藻酸钠作包埋介质的操作程序是：在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀，然后将其逐滴滴入2.0%2.5%的CaCl2溶液中，经2030 min的离子交换作用，即能形成含有繁殖体并具有一定刚性的小球珠（bead），再用水漂洗20