分子生物学遗传病基因诊断和治疗

1、分子生物学讨论三之遗传病的诊断与肿瘤基因治疗遗传病的基因诊断一、什么是遗传病遗传病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也可后天发病。遗传病的类型1、染色体病或染色体综合征：遗传物质的改变在染色体水平上可见，表现为数目或结构上的改变。2、单基因病：指一对等位基因的突变导致的疾病，分别由显性基因和隐性基因突变所致。3、多基因病：涉及多个基因起作用，与单基因病不同的是这些基因没有显性和隐性的关系，每个基因只有微效累加的作用，因此同样的病不同的人由于可能涉及的致病基因数目上的不同，其病情严重程度、复发风险均可有明显的不同，且表现出家族聚集现象，环境的影响较为显著。二、基因诊断1.基因诊断

2、概念2.基因诊断特点3. 基因诊断应用范围4、基因诊断的发展过程5、基因诊断遇到的问题6、遗传病基因诊断的注意事项基因诊断定义某些受精卵或母体受到环境或遗传等的影响，引起的下一代基因组发生了有害改变，产生了疾病，为了有针对性的解决和预防，故需要通过实验室的基因诊断、基因分析才能得到确认。又称DNA诊断或分子诊断。基因诊断的特点高特异性高灵敏度早期诊断性应用广泛性基因诊断应用范围1.检测病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病等2.诊断先天遗传性疾患，产前诊断优生学3.检测后天基因突变引起的疾病，如肿瘤4.其他比如亲子鉴定，法医物证基因诊断的发展过程1976年美籍华裔科学家简悦威应用液相DNA分子杂交技术

3、成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断 标志着人类遗传性疾病诊断开始进入基因诊断的新时代发展过程1、利用连锁分析和关联分析定位遗传病致病基因；2、利用分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；3、利用PCR技术进行遗传病的基因诊断；4、基因芯片用于基因诊断；5、利用外显子组捕获技术诊断单基因遗传病；6、利用全基因组（GWAS）关联分析定位及诊断多基因遗传病易感基因相关问题1、标准化问题：缺乏标准化的操作规程以及质量认证体系。各医疗机构的操作方法不统一，质量难保证；2、伦理学问题；3、所用资源及信息安全问题需要相对明确临床诊断需要及时向患者及其家属说明基因诊断的重要性，以启发上述成员的理解与主动性需要在基

4、因诊断中建立家系观点需要注意基因诊断中的伦理问题需要正确理解基因诊断报告需要充分理解产前基因诊断的风险遗传病的基因诊断的注意事项三、基因诊断方法1.核酸分子杂交2.聚合酶链反应3.单链构象多态性分析4.限制性片段长度多态性连锁分析序列测定6.单核苷酸多态性和全基因组关联分析7.生物芯片11.外显子组捕获技术3.单链构象多态性 单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，这种构象由碱基顺序决定。碱基变异则构象改变。而构象影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进

5、行分析。4.限制性片段长度多态性 该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性。 如果重排、缺失或者核苷酸置换使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段这种变化即可作为诊断指标。6.单核苷酸多态性和全基因组关联分析单核苷酸多态性： 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变

6、异所引起的DNA序列多态性。 全基因组关联分析英文名字叫Genome-wide association study简称GWAS 全基因组关联分析是指在人类全基因组范围内找出存在的序列变异，即单核苷酸多态性（SNP），从中筛选出与疾病/性状相关的SNPs。 7.生物芯片 又称为基因芯片(gene chip)、DNA微阵列(DNA microarray) DNA芯片技术基础是核酸分子杂交 应用微电子加工工艺，在玻璃、塑料、硅片等材料上制备用于生物样品分离、反应或分析的微细结构 目前主要有两大类： 1. 生物活性微阵列 (bioactive microarray) 2. 基因芯片 (gene chi

7、p), DNA微阵列 (DNA microarray) 包括多肽、蛋白质、病毒、 细胞等。蛋白质芯片可直接从体液中检测生物分子（免疫芯片只需少量样品可一次完成对成千上万种抗原或抗体等致病因素或生物样品的检测分析)。为最重要的生物芯片，广泛用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断、药物筛选、基因测序等。9.环介导等温核酸扩增技术 其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 左右) 保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应10.免疫组织化学诊断 对于某些基因表达水平发生改变的疾病可以采取免疫

8、组织化学方法进行诊断，优点是在不改变细胞结构的情况下，对基因表达终产物蛋白质水平及细胞中的部位进行分析外显子捕获(exon trapping) 是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。遗传病的基因诊断典型案例主要内容甲型血友病脆性X染色体综合征成年型多囊肾病DMD/BMD的缺失型脊髓小脑性共济失调甲型血友病血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病。其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。血友病可分为甲型、乙型、丙型和血管性假血友病4种。其中甲型发病率占人类先天性血液系统疾病的85%

9、。甲型血友病，即因子促凝成分（：C）缺乏症，也称AGH缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。甲型血友病的基因诊断主要鉴定患者家系中的携带者或对未出生的胎儿进行产前诊断。 甲型血友病的基因诊断1. 1.F 基因到位的DNA印记分析： 1）将基因组用限制性内切核酸酶消化 2）用特异探针杂交，放射自显影分析2. F 基因突变直接检测： 1）依赖于F 基因内或旁侧的多态性的连锁分析 2）RFLP连锁分析 3）VNTR分析 4）STR连锁分析对于甲型血友病进行基因诊断首先寻找有无基因到位，其次利用基因内的遗传标志进行连锁分析，最后采用PCRSSCP或PCRDGGE分析。脆性X染色体综合征脆

10、性X染色体综合征导致患者智障（Martin-Bell综合征），脆性X综合症是由于在人体内X染色体的形成过程中的突变所导致。在X染色体的一段DNA，由于遗传的关系有时会发生改变。一种为完全改变，另一种为DNA过度甲基化。如果这两种改变的程度较小，那么患者在临床表现方面可以没有特殊的症状或者只有轻微的症状。反之，如果这两种改变的程度较大，就可能出现如下所述的脆性X综合症的种种症状。 脆性X染色体综合征基因诊断常用的方法： （1）PCRASO （2）DNA连锁链分析 （3）Southern印迹杂交法 （4）PCR扩增成年型多囊肾病 成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病，发病率高，约1000人中有1

11、名致病基因的携带者，起病较晚，多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿，临床表现为腰疼、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，最终可导致肾功能衰竭和尿毒症。 诊断：本病基因定位在16p13，与珠蛋白基因3端相邻，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明。因此，只能用连锁分析来进行基因的发病前诊断和产前诊断。由于通过家系分析，已证实APKD的致病基因与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列即3HVR(3 hypervariable region)紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断。DMD/BMD的缺失型 DMD/BMD是一

12、种连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病。DMD/BMD有70%左右为缺失型。 诊断：此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位（图139），在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。脊髓小脑性共济失调 脊髓小脑性共济失调是以小脑性共济失调为主要症状的常染色体显性遗传性疾病，病理改变以小脑、脊髓、脑干变性为主，临床主要特征为小脑性共

13、济失调，可伴有构音障碍、震颤、锥体束征以及痴呆等。 诊断：依据神经系统临床检查的程序来判断患者是否存在小脑及脊髓神经失调的临床体征，然后会查问他的家族史（包括已故的亲人），最后结合磁共振（MRI）及基因测试，排除其他累及小脑和脑干的变性病，才能判断患者是否患上脊髓小脑性共济失调。遗传病的基因诊断以血红蛋白病为例血红蛋白病血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞

14、增多所致紫绀。异常血红蛋白病镰刀状红细胞贫血（Hbs）不稳定血红蛋白病（unstable hemoglobinpathies）血红蛋白M病（HbM）氧亲和力改变的血红蛋白病地中海贫血地中海贫血（-thalassemia,简称地贫）地中海贫血（梩halassemia,简称地贫）镰刀状红细胞贫血（Hbs）异常血红蛋白链的第6位谷氨酸被缬氨酸所代替。这个疏水氨基酸正好适合另一血红蛋白分子链EF角上的“口袋”，这使两条血红蛋白链互相“锁”在一起，最终与其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱形螺旋纤维束，使红细胞扭旋成镰刀形。诊断方法镰刀形细胞性贫血症的基因诊断可采用PCR-限制性内切酶谱分析法。先用PC

15、R从患者基因组DNA扩增含突变位点的珠蛋白基因片段。再选择适当的限制性内切酶水解PCR产物,根据酶切产物在电泳图谱上的片段数量和大小做出判断.也可与特意的寡核苷酸探针进行Southern印记杂交分析,根据杂交图谱做出判断.限制性内切酶采集制备血液DNA内切酶Mst消化电泳转膜P32标记的珠蛋白cDNA杂交放射自显影PCR/限制性内切酶设计引物PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切电泳EB染色直接观察地中海贫血 地中海贫血(-mediterranean anemia)是指 链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后36 个月内发病者占50%，偶有新生儿期发病者。

16、发病年龄愈早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，34 周输血1 次，随年龄增长日益明显。地中海贫血基因诊断PCR/ASO斑点杂交法 合成两对PCR引物 合成等位特异寡核苷酸探针 制备DNA样品 PCR扩增 斑点印迹杂交RFLP分析法肿瘤基因治疗基本策略和常用方法基本策略(一)治疗性基因的获得(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内（一）目的基因的选择和制备 基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。 要求：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。 在抗病毒和病原体的基因治疗中。所选择

17、的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的。制备目的基因：正向表达的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因组DNA(genomic DNA)片段。可用传统的方法（人工合成）获取，也可采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备。（二）基因的转运目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RN

18、A病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。【逆转录病毒用作载体时需进行几步改造（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因示。（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能。（3）将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。】非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体，载体优点缺点逆转录病素毒基因组小并且简单 可稳定整合于宿主基因组生物学特性清楚可高效

19、转入复制中的细胞对宿主细胞无害仅感染分裂细胞 随机整合（可能导致突变）常常只有短暂表达病毒滴度低（107pfu/ml）可能会与有复制能务的病毒重组插入容量有限（10kb）腺相关病毒基因组小（5kb） 可特异整合于人19号染色体以人细胞作为宿主无毒、无致病性尚未研究清楚 需腺病毒辅助复制携带外源基因能力有限（4kb）难得到高滴度病毒常见基因转运载体的优缺点腺病毒适于原位使用，尤其是肺 (在不分裂细胞中可进行高效率的体内感染)病毒滴度高（1010pfu/ml）生物学特性清楚不与宿主基因组整合(只有短暂表达) 载本基因组复杂病毒蛋白可能引起免疫反应及炎症反应插入外源基因能力有限（7-8kb）脂质体无

20、感染能力 理论上无DNA大小限制毒性低无特异性靶细胞 转染效率低仅有短暂表达体内应用困难受体介导的转运无感染能力 特异性转染靶细胞理论上无DNA大小限制构建灵活转染效率低 体内应用困难可能有免疫原性只有短暂表达（三）靶细胞的选择理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。（四）细胞转染 这是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术

21、。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。名称机制转染效率用途优缺点影响因素磷酸钙转染法内吞作用20%细胞被转染瞬时表达1、简单有效 2、适用于贴壁、非贴壁细胞3、常作首选方法1、Ca2+，DNA浓度 2、PH值，沉淀反应时间3、氯喹，甘油和丁酸钠处理DEAE葡聚糖转染法抑制核酸酶

22、 内吞作用在BDC-1，CV-1和COS细胞中较高瞬时表达操作简单1、需高浓度DNa 2、DEAE葡聚糖浓度3、温育时间Poly-brene转染法不清楚低分子量DNA转染率高于磷酸钙法CHO细胞的稳定转化子能得到较多的稳定转化子1、受体细胞类型 2、转染调控信号3、DNA浓度原生质体融合胞膜融合50-100%转染，稳定子得率为0.2-0.02%瞬时表达 稳定表达1、操作复杂 2、不能进行共转染3、慎用于筛选营养缺陷型变异株1、溶菌酶、PEG浓度 2、温育时间电穿孔高压在膜上形成微孔效率较高瞬时表达 稳定转化 1、需精密仪器 2、可用于动物、植物细胞和细菌1、电场强度 2、脉冲长度3、温度，DN

23、A浓度4、培养液脂质体脂膜融合50-60%转染瞬时表达 稳定转化1、操作简单 2、可用于体内试验1、脂质体质量 2、DNA浓度胞核微注射法直接注射50-100%转染稳定转化 1、需要特殊仪器 2、处理样品数量少3、高效1、注射技术 2、DNA浓度（五）外源基因的表达及检测在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。 常用方法 补偿性基因治疗 补偿性基因治疗是指向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常

24、的抑癌基因，逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗目的。 用基因替代等方法可恢复和增强肿瘤抑制基因的功能，如将克隆的抑癌基因Rb、p53、p16等导人肿瘤细胞，可以逆转其恶性行为，诱导细胞凋亡。 但是由于肿瘤发生、发展的机制十分复杂，涉及多种癌基因和抑癌基因的多步骤改变，因而难以通过拮抗某一种癌基因完全控制肿瘤的恶性行为。 抗肿瘤血管形成基因治疗 肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关，因此抗血管形成基因治疗是非常有潜力控制肿瘤生长的治疗方法。抗肿瘤血管形成基因治疗的研究主要包括：针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗，血管形成抑制因子基因治疗，针对肿瘤血管内皮细胞的自杀

25、基因治疗等。肿瘤耐药基因治疗 即化疗保护性基因治疗，是指化疗前向骨髓内导入耐药基 因，保护骨髓细胞不受抗肿瘤药物的损害。 有实验表明，将药物剂量提高510倍可以克服肿瘤细胞的抗药性，但大剂量化疗对人体正常组织及造血系统的损害较重，限制了化学药物的用量。 多耐药基因 (MDRl)编码P糖蛋白的跨膜蛋白，它有抗肿瘤药物位点和 ATP位点2个结合位点，通过ATP供能可将细胞内药物泵出 从而保护正常细胞免受药物损害。 目前，肿瘤耐药基因治疗的方案是转 入MDRI基因、DHFR基因、MGMT基因等，或者联合使用2 种或多种耐药基因转入造血干细胞，使造血干细胞获得广谱抗 药性。 自杀基因疗法 自杀基因疗法又称为病毒导向的酶解前药疗法 其原理是将一些病毒或细菌基因组中的前 药转换酶基因（也叫自杀基因)导入肿瘤细胞，该基因 编码特殊的酶可将原先对高等动物无毒性的前药在 肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞自 杀。 其作用是：促进免 疫效应细胞的分化增殖、