第四章 第2部分肉毒梭菌副溶血性弧菌蜡样芽孢杆菌检验

1、第四章 第2部分肉毒梭菌副溶血性弧菌蜡样芽孢杆菌检验2、培养特性最严格的厌氧菌 生长最适温度：28 37 ：pH为6.87.6，产毒的最适pH。产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型温度高些为宜，35 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。 肉毒梭状芽孢杆菌菌落 在固体培养基表面上，形成类圆形，边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。3、肉毒梭菌的生化特性 表1 各型肉毒梭菌的生

2、化反应二、肉毒梭菌的致病性 肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据毒素的抗原特异性将其分为A、B、C （1、2） 、D、E、F、G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。 A型毒素经602分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、E二型毒素要经702分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵抗更大些；C型毒素要经过902分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75加热510分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。 肉毒毒素是一种神

3、经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。 肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多，日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）发生中毒较多。 三、检验方法1、检验标准：2、培养基和试剂培养基：庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。试剂： 肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰氏染色液。 另需实验动物（小白鼠）。3、检验程序检 样毒素检测增菌、产毒培养30，5

4、 d报告（一）毒素检测报告（二）分离培养培养检查毒素检测报告（三）增菌产毒培养30，5 d 观察生长性状，染色镜检观察菌落性状染色镜检报告(一)：检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中毒诊断，即可结束检验)报告(二)：对增菌产毒培养物，一方面做生长特性观察，同时检测肉毒毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，则应从培养着手）报告(三)：欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必要从检样中分离纯的菌株，但研究或特殊需要例外

5、）（1）、肉毒毒素检测注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。液态或固体样品经过适当处理后离心，取上清液实验 上清液及其胰酶激活处理液 分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，观察4 d 确证试验毒力测定 定型试验 取庖肉培养基五支，煮沸10min15min，做如下处理：第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL2 mL；第二支：冷却至60，接种检样，继续于60保温10 min，急速冷却；第三支：接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。第四支：急速冷却，接种肉毒梭菌菌种。第五支：急速冷却，作为空白对照。 以上5支试管于30厌氧培养5d，若无生长，可再培

6、养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。（2）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验） 选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35厌氧培养48 h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠层样)薄层，但G型菌无此现象。 根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。（3）、分离培养（1）毒素检测：试验方法同上。（2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份，分别在35的需氧和厌氧

7、条件下培养48 h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需氧条件下不生长。4、结果报告报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。第五节、副溶血性弧菌检验一、生物学特性1、形态与染色 革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌或稍弯曲弧菌 ，有时呈棒状、甚至球状、丝状等。单端鞭毛。无芽胞、无荚膜。 2、培养特性需氧或兼性厌氧嗜盐，在2%NaCL培养基中生长最好，无盐或食盐10%不能生长。最适温度36，在固体培养基

8、上菌落呈圆形凸起，混浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐。在血平板上可见溶血环。 3、生化特性分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖，蔗糖。H2S（）、V-P（）、靛基质（+）、精氨酸（）甲基红（+）、赖氨酸（）、溶血/-O抗原：O1O13 13种。H抗原：K抗原：K1K71 65种。（ 缺编：K2 、 K14 、K17、 K35、 K62）血清分型：所有副溶血性弧菌的H 抗原均相同，但是O 抗原和K 抗原存在差异，以13种O抗原及65种K抗原将其分为13个群和845个型。4、抗原结构二、致病性1、致病因素侵袭力：活菌(105107/g)，可使人致病 .产生溶血毒素：耐热性溶血毒素(THD)和耐热

9、性溶血毒素相关的溶血毒素(TRH)，此外有的可产生不耐热溶血毒素(TLH)。 2、媒介食品 主要是海产品（鱼、虾、蟹、蛤等），含盐量较高的食物亦可带菌。3、所致疾病 食物中毒、急性胃肠炎、败血症等。 1、检验标准：GB/T 4789.7-2008 副溶血性弧菌检验2、培养基和试剂培养基：3氯化钠碱性蛋白陈水APW) 、 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂 3氯化钠胰蛋白胨大豆TSA）琼脂 3氯化钠三糖铁（TSI）琼脂 嗜盐性试验培养基 3氯化钠甘露醇试验培养基 3氯化钠赖氨酸脱狡酶试验培养基 3氯化钠MR-VP培养基 我妻氏血琼脂、弧菌显色培养基试剂：氧化酶试剂、革兰氏染色液、O

10、NPG试剂、3%氯化钠溶液、 V-P试剂、API20E生化鉴定试剂盒等。三、检验方法3、检验程序（1）样品处理及培养 定量测定：样品用3%氯化钠蛋白胨水 10倍连续稀释后取三个稀释度各接3支含有该培养基的试管，培养。 定性检测：用上述1:10稀释液增菌培养。（2）分离：有菌生长的试管分别接种TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离、培养。（3）纯培养：挑可疑菌落划线分离。（4）初步鉴定：生化实验和镜检鉴定。（5）确定鉴定：生化试验鉴定。（6）报告 定性检测或定量检测。（7）血清学分型：（选做）（8）神奈川试验： 分离：在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，划线分离。副溶血性弧菌在T

11、CBS琼脂平板上的典型菌落：圆形、半透明、表而光滑、质感类似口香糖、直径2mm3mm的绿色菌落。（培养基中含溴麝香草酚兰和H2S指示剂 ，因副溶血性弧菌不分解蔗糖、不产H2S，为绿色菌落）副溶血性弧菌混合菌种副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上典型菌落特征：呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm3mm。初步鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行副溶血性弧菌的初步鉴定：副溶血性弧菌：氧化酶试验：阳性。涂片镜检：G-，棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。3氯化钠三糖铁斜面 ：底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。嗜盐性试验：分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水中培养，在无氯

12、化钠和10氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7氯化钠的胰胨水中生长旺盛。生化试验：分别接种各类生化培养基，培养后观察结果。或API20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物检测系统鉴定。生化性状符合下表要求时，为副溶血性弧菌 。确定鉴定:项目 结果项目 结果革兰氏染色镜检阴性，无芽孢乳糖 氧化酶 硫化氢动力 赖氨酸脱梭酶 蔗糖V-P 葡萄糖 ONPG 甘露醇分解葡萄糖产气 表 副溶血性弧菌的生化性状定性检测：报告25g（ml）样品中是否检出副溶血性弧菌。定量检测：根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。报告：神奈川试验： 测试副溶血性弧

13、菌分离株是否存在特定溶血素（与致病性显著相关）。将测试菌点种在我妻氏血琼脂平板上，培养后观察是否有溶血现象。阳性结果为菌落周围呈半透明环的溶血。 第六节、蜡样芽胞杆菌（一）生物学特性1、形态与染色 革兰氏阳性大杆菌，宽度在1 m或1 m以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。需氧，最适生长温度3032。在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂平板上，菌落灰白色，不透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。 在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有溶血环。在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌落呈粉红色，具有白色混浊环（不发酵甘露醇、产生卵磷脂酶）2、

14、培养特性能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。3、生化反应 食品蜡样芽胞杆菌数量106/g（mL）时常可导致食物中毒，导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。肠毒素类型：耐热性肠毒素：10030min不能被破坏，常在米饭中形成。不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。二、致病性三、检验方法1、检验标准； GB 4789.142003 2、培养基和试剂培养基:肉浸液肉汤培养基 酪蛋白琼脂培养基动力-硝酸盐培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水血琼

15、脂培养基 木糖-明胶培养基甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、试剂：0.5%碱性复红染色液、革兰氏染色液、3%过氧化氢溶液、甲萘胺-乙酸溶液、对氨基苯磺酸-乙酸溶液。3、检验程序361 12 h 20 h37，18 h 24 h361 12 h 20 h检 样25 g（mL）加225 mL生理盐水菌数计算做成10-110-5的稀释液选择性培养基（分离培养）MYP营养琼脂培养基生长及菌落观察染色镜检生化试验菌株保存报 告选择性培养基（菌数测定）MYP包括四个步骤：菌数测定:涂布甘露醇卵黄多粘菌素（MYP） 平板计数。分离培养:从MYP上 挑可疑菌落进行纯培养。 证实实验:包括形态观察、培养特

16、性、生化性状和生化分型试验。与类似菌的鉴别：主要是与苏云金芽孢杆菌的鉴别。结果报告：报告每g（mL）检样中所含的蜡样芽孢杆菌数。 将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取5个典型菌落做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。蜡样芽孢杆菌数=可疑菌落数证实为阳性菌落数的比例稀释倍数10菌数测定：MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素可抑制杂菌的生长。蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为粉红色（否则为黄色）。该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷脂被分解，在菌落周围产生粉红

17、色的晕。分离培养和证实试验: 分离培养：从MYP平板上挑可疑菌落到营养琼脂上进行纯培养。证实试验：（1）形态观察（2）培养特性（3）生化性状及生化分型生化性状 本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。生化分型 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化性状的试验，分成不同的型别。型 别生 化 试 验柠檬酸盐利用硝酸盐还原淀粉水解V-P反应明胶液化123456789101112131415表1 蜡样芽孢杆菌生化分型表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别项 目巨大芽孢杆菌

18、蜡样芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌蕈状芽孢杆菌炭疽芽孢杆菌过氧化氢酶动力硝酸盐还原酪蛋白分解卵黄反应葡萄糖利用（厌氧）甘露醇木糖溶血已知致病菌特性/产生肠毒素/对昆虫致病的内毒素结晶/假根样生长/对动物和人致病 注： 90%100%的菌株阳性； 90%100%的菌株阴性；/ 大多数菌株阳性；/ 大多 数菌株阴性。与类似菌鉴别：鉴别： 蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体，蜡样芽孢杆菌无。苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体蜡样芽孢杆菌第七节、其它致病菌的检验一、单核细胞增生李斯特氏菌检验GB 4789.30-2010 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验二、致泻性大肠埃希氏菌检验GB/T 4789.6-2003 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验三、小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T 4789.8-2008 食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验四、空肠弯曲菌检验GB/T 4789.9-200