第9章经典液相色谱法

1、经典液相色谱1 LSC 2 LLC3 ICE4 SCE5 TLC6 PC第10章 经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱法，是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流动相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度和检测灵敏度等方面。 经典液相色谱法设备简单，操作方便，分析速度快。 在药物研究、食品化学、环境化学、临床化学、法检分析及化学化工等领域都有广泛的应用。特别是在天然药物成分的鉴别、分离等方面发挥着独特的作用，是中药鉴别的主要方法之一。 第1节 液-固吸附柱色谱法（LSC） 经典的液固吸附色谱（liquid solid adsorpti

2、on chromatography，LSC）是以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附力的差异，进行分离分析的方法。 用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分离分析强极性的物质。一、基本原理 1吸附与吸附平衡 吸附是指溶质分子与吸附剂分子之间所存在的某些化学作用力而被吸附在吸附剂的表面。 吸附过程则是试样中溶质分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程（图10-1）。图10-1 吸附色谱示意图m.流动相 a.吸附剂 Xm.流动相中溶质分子,Ya.被吸附流动相分子 Ym.流动相分子 Xa.被吸附的溶质分子 吸附平衡常数: 由于流动相分子是

3、大量的,所以Ym/ Ya 可视为常数。 （10-2） 为吸附剂的表面积， 为流动相的体积，Cs为溶质在固定相的浓度，Cm为溶质在流动相中的浓度。吸附平衡常数K是与组分的性质、吸附剂和流动相的性质与温度有关的一个常数。 K值小，说明溶质在固定相的浓度低，即被固定相吸附得不牢固，易被流动相分子解吸附，在柱中移动速率快，先流出色谱柱； K值大，说明该物质被吸附得牢固，移动速率慢，后流出色谱柱， 2吸附等温线 一定温度与压力下,当吸附达到平衡时，某组分在固定相中的浓度与在流动相中的浓度,随物质总量的变化而变化的关系曲线。 （1）线性吸附等温线 吸附平衡常数K为一定值时，则吸附等温线为线型。即达到平衡时

4、，组分在固定相中的浓度Cs与其在流动相中的浓度Cm 成正比(Cs=KCm)，直线的斜率为K。 线型吸附等温线是理想的等温线，同一种溶质的平衡常数K与溶液的浓度无关，即K为一常数。组分流出速度不受浓度的影响，故在洗脱或展开时，同一溶质分子在柱内具有相同的迁移速率，能得到左右对称的流出曲线。如图10-2A所示。（2）凸形吸附等温线 在绝大多数情况下，吸附等温线都有些弯曲而呈现凸形吸附等温线。其中主要原因之一是固体吸附剂表面的不均一性。 例如硅胶表面上有几种吸附能力不同的吸附中心强的、较强的、弱的、极弱的 同一溶质分子总是先占据强的吸附中心，两者之间作用力强，溶质分子被吸附得牢，吸附平衡常数K值大，

5、迁移速率慢；后占据弱的吸附中心，两者之间作用力弱，吸附平衡常数K值小，迁移速率快，并依此类推。 显然，同一溶质分子具有不同的吸附平衡常数K，即具有不同的迁移速率。在溶质分子集中的区域，吸附剂的所有吸附中心达到吸附饱和，K值小，迁移速率快，先流出色谱柱；在溶质分子稀少的区域，由于仅仅占据了强吸附中心，K值大，迁移速率慢，后流出色谱柱。从而导致流出曲线前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留时间亦随样品量的增加而减小。如图10-2B所示。（3）凹形：由于进样量较大，影响了固定相的物理性质。随溶质量的增加, Cs/Cm增加，所以呈凹形。吸附等温柱内溶质浓度分布柱内溶质浓度的分布曲线流出曲线 保留时间与

6、进样量的关系 L拖尾峰的出现对以下产生了不利的影响：利用峰面积进行定量时峰面积的积分精度和重现性。利用峰高定量时检测的灵敏度。定性分析时保留值与物质性质的相关性。组分之间相互分离的程度。 因此应尽量避免色谱峰的拖尾。 克服的方法是：减小进样量或样品的浓度，即利用凸形吸附等温线的直线部分，从而得到左右对称的流出曲线。二、 吸附剂 对吸附剂的要求： (1)表面积大，具有一定的吸附能力。 (2)不应与流动相发生化学反应。 (3)粒度要细，一般要150目。吸附剂： 常用的有：氧化铝、聚酰胺、硅胶等。(2) 硅胶: 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸与中性物(如有机酸、氨基酸、甾体等)。硅醇基是使硅胶有

7、一定吸附能力的活性基团。 三种存在形式: 吸附能力 ： 活性大小 ： (3) 聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物质。 其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基。 酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧基形成氢键； 酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的硝基形成氢键而产生吸附作用。不同的化合物，由于活性基团的种类、数目与位置的不同，形成氢键的能力不同，而实现分离。 对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较多共轭键时,吸附力增大。（4）大孔吸附树脂 大孔吸附树脂是一种不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。粒度多为20-60目。理化性质稳定，不

8、溶于酸、碱及有机溶剂。大孔树脂可分为非极性和中等极性两类，在水溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性，而在有机溶剂中吸附能力较弱。 大孔吸附树脂主要用于水溶性化合物的分离纯化，近年来多用于皂苷及其它苷类化合物与水溶性杂质的分离。也可间接用于水溶液的浓缩，从水溶液中吸附有效成分。 硅胶含水量（%）氧化铝含水量（%）活度级别051525380361015表10-1 硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系2. 吸附剂的活性： 氧化铝、硅胶的吸附力的大小, 还与其含水量有较大的关系：注意:吸附剂的吸附活性(能力)与活度级别的相反关系 活度级数 含水量 活性 吸附能力 小 少 大 强 大 多 小 弱 所以，

9、加热除水，活性提高，吸附力加强。 加一定水，活性下降，吸附力减弱。 活化：105110加热除水为活化。 脱活：加一定水份，降低活性。 三. 流动相(洗脱剂、展开剂或移动相): 流动相极性大，对被测组分的洗脱能力大要求: 1. 纯度高 2. 稳定(对样品和吸附剂不反应) 3. 对样品溶解度大 4. 粘度小(易洗脱)。常用流动相极性强弱顺序: 石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 甲苯几 乙醚 氯仿 醋酸乙酯 正丁醇 丙醇 乙醇、甲醇 水 被分离物质的极性 吸附剂活性 流动相极性 大 小 大 小 大 小以上三方面只是一般性原则 , 至于使用哪种 , 要由实验来摸索。流动相选择灵活性很大 , 往往可用一元

10、, 配两元或三元。也可采用梯度洗脱等技术 。 四、色谱条件的选择由于吸附剂的种类有限，因此，当被分离物质、吸附剂种类一定时，分离成败 的关键取决于流动相的选择 1. 被分离物质的极性与吸附剂的吸附力之间的关系 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢!常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 烯烃 醚类 硝基化合物 二甲胺 脂类 酮类 醛类 硫醇 胺类 酰胺 醇类 酚类 1 , 说明B+ 较牢地结合在树脂上 KB/A 1 , 说明A+ 较牢地结合在树脂上 所以KB/A说明了树脂对A+、 B+两种离子选择性交 换的能力,故也称之为选择性系数。 KB/A , B与树脂结合能力强 , 洗脱慢 , tR 。2

11、. 选择性系数与分配系数的关系: 即: 分配系数不同是离子交换分离的先决条件。 第4节 空间排阻柱色谱法（SEC） 空间排阻色谱(steric exclusion chromatography，SEC)是20世纪60年代发展起来的一种色谱分离方法，又称为：凝胶色谱法(gel chromatography) 分子排阻色谱法(molecular exclusion chromatography)分子筛色谱法(molecular sieve chromatography) 尺寸排阻色谱法(size exclusion chmmatography)。 该色谱法根据流动相的不同又可分为两类：以有机溶剂为

12、流动相者，称为凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，GPC) ；以水溶液为流动相者，称为凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography，GFC)。主要用于大分子物质如蛋白质、多糖等的分离。一、基本原理 以凝胶（有机高分子的多孔聚合物）作为固定相，有机溶剂或水溶液作为流动相，利用样品中不同组分的分子尺寸的差异以实现混合物的分离。 第5节 薄层色谱法TLC 操作流程: 铺板 活化 点样 饱和 展开 显色 定性 , 定量。 一. 基本原理: 1.分离过程 将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密闭容器中用适当的溶剂 (展

13、开剂、流动相) 展开, 各组分不断地被吸附, 解吸附 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分的吸附力 (吸附常数)不同, 产生差速迁移, 而达到分离。 特点: 快速、灵敏(几几十微克)、 高选择、显色方便。 RfA= a / c RfB = b / c2. 比移值 比移值 当固定相、流动相一定时，Rf与与组分性质K的关系如下：色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为Rf = 0 未移行 (被固定完全吸附, K )Rf = 1 移至前沿 (组分不被固定相吸附, K 0 ) 一般: 0 Rf 1 1）固定相、流动相一定时， Rf值与物质极性的关系是：物质的极

14、性，K，吸附得越牢，移动距离越小，Rf物质的极性，K，吸附得越弱，移动距离越大，Rf 2）固定相、组分的极性一定时，Rf值与展开剂极性的关系是： 展开剂极性，Rf（容易洗脱） 展开剂极性，Rf （不容易洗脱） 3）展开剂、组分的极性一定时，Rf值与固定相吸附力的关系是 固定相吸附力，Rf 固定相吸附力，Rf Rf最佳范围: 0.30.5 , 也可控制在0.20.8范围内。 3相对比移值 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现 性差。有人建议用相对比移值定性。 参考斑点可以是另加的物质,亦可以样品中另一组分为参考。4.分离度分离度（R）的计算公式为： d2为第2个色谱斑点的中心与原点

15、的间距d1为第1个色谱斑点的中心与原点的间距W1及W2为相邻两斑点的直径一般分离度应大于1.0。123456溶剂前沿T=23 RH=62%图1 延胡索薄层色谱鉴别（365nm紫外光灯检视）1.妇科养坤丸(EEC002) 2.妇科养坤丸(EEC001) 3.妇科养坤丸(E05005) 4.延胡索对照药材 5.延胡索乙素对照品 6.延胡索阴性对照图一：硅胶HPTLC 分离金光菊属植物（紫锥花类）根部提取物，从左到右分别为：海胆苷、咖啡酰酒石酸、紫锥菊、紫锥菊蒲草（75:25）、紫锥菊蒲草（50:50）、紫锥菊蒲草（25:75）、蒲草、洋蓟酸、菊聚酸。二. 固定相 1. 吸附柱色谱的固定相薄层色谱也

16、可以使用, 但薄层色谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。 硅胶 70 m (一般要求200目左右) 符号: 硅胶G 硅胶 + 石膏 硅胶H 硅胶(未加任何物质) 硅胶HF254 硅胶不含粘合剂+荧光物质 硅胶GF254 硅胶+石膏+荧光物质 荧光剂：Mn激活的ZnSiO4（F254），在紫外光（254nm）灯下呈淡绿色荧光 Ag激活ZnS、CuS（F365），呈绿色荧光三. 展开剂选择: (同柱)仅操作方法不同。 分离强极性物质, 选择强极性展开剂, 同时也应考虑固 定相的活性。 物质极性 吸附力 流动相极性 防止 大 强 大 太牢, Rf太小 小 弱 小 Rf太大 分离混合样品时, 展

17、开剂选择一般规则: (1)先用单一的中等极性展开剂试一下。 (2)改用二元展开剂, 其比例要摸索。 目的: 改变展开剂的极性。 图10-6 点滴试验法例: A、B两组分试样 A B 展开剂 苯 Rf 0.45 0.42 分不开 改为 苯+乙醇 Rf 0.52 0.46 可分开 能否说出 A、B哪一组分极性大？ 解：B的极性大。因为在相同的色谱条件下,物质极性越大, Rf. 此外，为提高分离度、防止斑点拖尾，通常： 分离酸性成分，使用酸性展开剂。 分离碱性物质，使用碱性展开剂。填空题当其他条件一定时,欲增加Rf值,应展开剂的极性四、操作方法 1. 薄层（硬）板的制备 (1)载板的准备 多用玻璃板

18、作为载板，也可用塑料膜和金属铝箔，要求表面光滑,平整清洁，以便吸附剂能均匀地涂铺于上。常用规格有10cm10cm、10cm20cm、20cm20cm等。(2)薄层(硬)板的铺制 粘合剂 煅石膏：吸附剂的9-15%左右 羧甲基纤维素钠CMC-Na：0.5-1%水溶液 合成有机物：聚乙烯醇2.5%（有时对显色剂无效）铺板方法 手工铺板与机械铺板各种吸附剂铺板方法 硅胶G 硅胶H 氧化铝G（含9%煅石膏）2. 点样点样体积：一般在1 10l, 点样量太大, 斑点易拖尾 点样方式： 接触式点样与喷雾式点样原点形状： 点状、条状点样器具： 微量进样器、定量毛细管；底 距： 1.52cm点 距： 0.8

19、1.5cm原点直径： 23 mm。（边点边热风吹） 1 、 2样品 3 标准品1 2 30.5-1.0cm起始线底距2.0cm 0.8-1.5cm 点距溶剂前沿展开缸板浸入展开剂的深度展开剂接触式点样注意事项： 1.正确选择溶解样品的溶剂, 防止点样环形色谱效应 2.原点直径一般以3mm为宜 3.防止点样毛细管损伤薄层表面 4.尽量避免多次点样 点样环形色谱效应： 在点样的同时，试样溶液在原点呈环状展开，如果试样中各组分在溶剂中的溶解度很大，原点将变成空心环，称为“点样环形色谱效应”。克服方法: 应选择样品组分溶解度相对较小的溶剂以避免此现象的产生。喷雾式点样点样仪（Linomat5 半自动点

20、样仪）喷雾（非接触式）点样的优点： 点样过程中，点样器不与薄层板接触，可防止薄层板表面物理损伤。 能减少样品横向、纵向扩散，样品斑点窄，展开后分离度提高。 自动化程度高，样品溶液不易在针壁上残留，可提高点样的准确度与重现性。3.展开 将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层板上固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上迁移一定距离的过程称为展开，见图10-9。（1）展开装置 常用的展开装置有直立型的单槽色谱缸和双槽色谱缸（常用其规格有10cm10cm、10cm20cm、20cm20cm等）、圆形色谱缸、卧式色谱缸等。 (2)展开方式 一般展开方式 ：上行、斜行与下行展开距离：615cm注意点：

21、薄层板浸入展开剂中的深度约0.5cm, 不能浸住起始线, 层析缸应密闭。 先饱和1530分钟,再展开,防止边缘效应。 边缘效应是指同一物质的色谱斑点在同一薄层板上出现的两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。 产生该现象的主要原因是由于色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等。展开剂中极性较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发的快些，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂比例增大，故Rf值相对变大。 a）TLC 第一次展开、 b）TLC 第二次展开、单向多次展开 用同一种展开剂，沿同一展开方向展开多次。通过增加展开距离,达到更好的分离效果特殊展开方式 ：不同展开距离对结果

22、的影响，硅胶HPTLC 分离洋甘菊油， a）3 cm b）5 cm c）7 cm d）9 cm。abcd原点12双向展开双向展开 第一次展开后，取出，挥去溶剂，将薄层板旋转90o角后，再改用另一种展开剂展开。见图10-11。单向多级展开 用不同的展开剂，沿同一展开方向展开多次。以达到更好的分离效果。 离心展开薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。薄层色谱展开时相对湿度的影响不同相对湿度色谱结果显示，苍术在较高湿度条件下分离效果较好。薄层色谱展开时温度的影响耐用性试验（Robustness）薄层色谱法变动因素：不同厂牌的薄层板。不同点样方式。展开温度及相对

23、湿度的变化等。系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。目的为用于常规检验提供依据。4.色谱斑点的检出 1、有色化合物肉眼观察，直接定位2、无色化合物有紫外吸收UV光下斑点有荧光荧光板上有暗斑(显色剂定位)喷雾或浸渍显色蒸气显色：碘-生物碱、氨基酸衍生物、 肽类、脂类及皂苷喷雾或浸渍后加热显色显色剂：通用有碘、硫酸不仅有紫外吸收且能产生荧光的物质只有紫外吸收不能产生荧光的物质无紫外吸收(物理定位)硅胶GF254板硅胶G板五. 定性 定性分析方法: 将待定性组分与对照品点在同一薄层板上，比较组分与对照品色谱斑点颜色与Rf值的一致性。 对未知样品,要几个展开体系均有一致Rf值,才可认

24、为同一物质。 样对12345 6溶剂前沿T=23 RH=62%图1 延胡索薄层色谱鉴别（365nm紫外光灯检视）1.妇科养坤丸(EEC002) 2.妇科养坤丸(EEC001) 3.妇科养坤丸(E05005) 4.延胡索对照药材 5.延胡索乙素对照品 6.延胡索阴性对照点样顺序从左至右分别为连续三批供试品、对照药材、对照品、阴性对照六、定量: （一）洗脱法:误差 5 % (基本符合微量分析误差要求)。薄层分离 取下斑点 洗脱 离 心 取上清液进行测定 （二）薄层扫描法（TLCS）: 误差 5 % (符合要求)。 薄层扫描法又称原位定量薄层扫描法（in situ quantitative thin

25、 layer chromatography, QTLC）。本法是将一定波长的单色光垂直照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸收度随展开距离的变化，所得关系曲线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或量成正比，这种定量分析方法称为薄层扫描法。 1.基本原理 Kubelka-Munk理论 由于薄层板上的固定相，对光的散射现象，色谱斑点中待测物质的吸收度与浓度的关系不符合比尔定律。Kubelka-Munk理论充分阐明了薄层色谱斑点中待测物质的吸收度与浓度的定量关系。 (克曼方程) 设薄层板上固定相的厚度为X,入射光的强度为I0，当透过厚度x的固定相后，照射在微分薄层厚度dx上的入射光强与反射光强分别为

26、i和j时，见图10-12。其入射光强的增量与反射光强的增量分别符合下面两个微分方程 （10-9） （10-10） 式中S为薄层单位厚度的散射系数，K为薄层固定相单位厚度的吸光系数.K值与薄层色谱斑点中待测物质的浓度成正比。K虽称为“吸光系数”，仅因“单位厚度”而得名。 将式（10-9）与式（10-10）联立求解，可得透过x薄层厚度固定相后的透过光强i及反射光强j与色谱斑点中物质的浓度或量之间的关系（体现在参数a及b中的K）。 （10-11） （10-12） 式中 ， ， A和B均为常数。 在薄层扫描时，我们通常只考虑薄层板的上表面（x =X）反射光的强度j及薄层板的下表面（x =0）透过光的强

27、度i与色谱斑点中的待测物质的浓度或量的关系。 图10-12 散射性薄层截面示意图I0照射强度； i(x)-x处的透射光强；j(x)-x处的反射光强；x固定相层厚（1）薄层色谱斑点的反射率 在薄层板的上表面，即 x =X处，I =I0，j = I0R。则 （10-13） 式中SX为薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度及涂布均匀程度有关，其值的大小直接影响到偏离比尔定律的程度。KX为吸收参数，相当于薄层色谱斑点单位面积中待测物质的量( )。 当SX一定时(如Merck厂生产的硅胶板SX=3，氧化铝板SX=7)，R与色谱斑点中待测物质的量（KX）符合上式。（2）薄层色谱斑点的透光率T 在薄层板的

28、下表面，即x =0处，I =I0T，j = 0。则 （10-14） 同理，当SX一定时，T与色谱斑点中待测物质的量（KX）符合上式。（3）薄层色谱斑点的吸光度A 理想的空白薄层板的单位薄层厚度的吸光系数K=0。事实上，一般空白板K0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。在透射法中薄层色谱斑点的吸光度为 在反射法中薄层色谱斑点的吸光度为 ( T斑点透光率.T0空白板透光率）(R斑点反射率.R0空白板反射率）（4）Kubelka-Munk曲线 根据Kubelka-Munk方程，当SX0时，色谱斑点中待测物质的吸光度A与其浓度或量

29、(KX)虽仍然存在严格的定量关系，但不是一种直线关系。见图10-15 ，图10-16。 显然这给定量分析带来不便。为方便定量，必须对其曲线进行校直。SX=20X=10SX=0SX=0SX=10SX=20（5）Kubelka-Munk曲线的校直 日本岛津CS系列的薄层色谱扫描仪均有线性补偿器(line-arizer)，其工作原理即根据Kubelka-Munk方程式用电路系统将弯曲的曲线校正为直线后用于定量， 瑞士CAMAG公司SCANNER系列的薄层色谱扫描仪，则采用计算机进行线性回归或非线性回归，求出回归方程，然后进行定量分析。2.扫描条件的选择 （1）光学模式(Photo Mode)的选择

30、光源单色器 透射法 光源与光电检测器安装在薄层板的上下两侧。光源发出的光经单色器（或滤光片）后成为一定波长的单色光，光束照到薄层斑点上，测量的是透射光的强度。 本法适用于透明的凝胶板和电泳胶片。光源单色器 反射法 光源与光电检测器安装在薄层板的同侧。光源发出的光经单色器（或滤光片）后成为一定波长的单色光，光束照到薄层斑点上，测量的是反射光的强度。 本法适用于不透明薄层板，例如硅胶、氧化铝薄层板。（2）波长模式( Mode)的选择 单波长模式 单波长扫描是使用一种波长的光束对薄层进行扫描，又可分为单光束及双光束两种形式 检测器光单色器光单色器分光镜检测器检测器 双波长模式 双波长扫描是采用两种不

31、同波长的光束，先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两波长吸光度之差，此法优点：消除了背景的吸收干扰，显著改善基线的平稳性。光波长1波长2检测器斩波器检测器 参比波长R化合物吸收最小的波长 测定波长S化合物的最大吸收波长。（3）扫描模式直线式扫描应用一长方形光束（其长度大于斑点直径）以直线轨迹通过色谱斑点。适用于圆形规则的斑点，且扫描结果受扫描方向的影响。锯齿式扫描照射在薄层板上的光束与薄层板的相对运动的轨迹呈锯齿形或矩形。 适用于任何形状的斑点，扫描结果不受扫描方向的影响。直线扫描锯齿扫描斑点ABC3.定量分析方法 通常使用的定量分析方法是随行标准、外标两点法。所谓随行标准，即是把样品溶液与对照

32、品溶液点在同一薄层板上，展开，测定。目的是克服板间误差，提高定量分析的准确度。外标两点法则是配制高低两种不同浓度的对照品溶液，分别点在薄层板上，测定峰面积。 用两种浓度的对照品液(或一种浓度、两种点样量)与样品液对比定量。 m = a + b A样 式中: b = m1-m2/A1-A2 a = m1-bA1 为了提高测量精度，通常相同体积同一浓度的对照品溶液点2个斑点，相同体积的样品溶液点34个斑点，且交叉点样于同一薄层板上，展开，测定。 LL（一）高效薄层色谱法（HPTLC） 高效薄层色谱法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)

33、所用的硅胶为5m或10m，颗粒分布范围窄，流动相流速慢，容易达平衡，展开过程中传质阻力较小，斑点较为圆而整齐。因此，高效薄层色谱具有分离效率高、灵敏度高、展开时间短等优点。b）HPTLC 单次展开。a）TLC 单次展开、参数TLCHPTLC板尺寸（cm）颗粒直径（m）颗粒分布点样量(l)原点直径(mm)展开后斑点直径（mm）有效塔板数有效板高（m）点样数展开距离（cm）展开时间（min）最小检测量：吸收（ng）荧光（pg） 2020 50100 宽1536615 600 3010 1015 30200 15 501001010520窄0.10.211.5255000 12 1836 36 32

34、0 0.10.5 510（二）胶束薄层色谱法（MTLC） 以胶束水溶液为流动相的薄层色谱法称为胶束薄层色谱法（micellar thin layer chromatography，MTLC）。该系统具有固定相-流动相-胶束-固定相、三个界面、三个分配系数，因此有较好的选择性。胶束水溶液无毒、便宜、安全。 由于分配、吸附、静电、增溶等效应，待测样品中各组分在薄层板上有不同的迁移速度，从而实现分离。该法具有独特的选择性、可同时分离亲水性和疏水性物质，对带电成分和非带电成分也有较好的分离效果。适用于分离差别很小的物质。 7 纸色谱法 一. 基本原理 LL分配色谱 载体: 滤纸的纸纤维 固定相: 滤纸上吸附的水分(2026%水分中有6%的 水分通过氢键与纤维素 上的羟基结合成为 复合物)或甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇或缓 冲溶液 。 流动相: 与水不相混溶的有机溶剂。 定性参数: Rf 操作类似于薄层,但原理却不同。 (一)Rf与K的关系: Rf大（ K小）, 极性小的物质; Rf小（ K大）, 极性大的物质。 各组分K不同,就有不同的Rf, 从而得以分离。 (二) Rf的影响因素: 1. 物质的化学结构: 极性大的物质, 水中分配多, Rf小。 极性小的物质, 水中分配少, Rf大。例: 葡萄糖 鼠李糖 洋地黄