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1、 第六章 微生物的代谢第六章 微生物的代谢微生物在生长发育和繁殖过程中,需要不断地从外界环境中摄取营养物质,在体内经过一系列的生化反应,转变成能量和构成细胞的物质,并排出不需要的产物。这一系列的生化过程称为新陈代谢。微生物的代谢(metabolism)是指发生在微生物细胞中的分解代谢(catabolism)与合成代谢(anabolism)的总和。 分解代谢(catabolism)指细胞将大分子物质降解成小分子物质,并在这个过程中产生能量。合成代谢(anabolism)指细胞利用小分子物质合成复杂大分子的过程,并在这个过程中消耗能量。在代谢过程中,微生物通过分解作用产生化学能,光合微生物还可将光

2、能转化成化学能,这些能量用于:1.合成代谢;2.微生物的运动和运输; 3.热和光。无论是分解代谢还是合成代谢,代谢途径都是由一系列连续的酶反应构成的,前一部反应的产物是后续反应的底物。细胞能有效调节相关的酶促反应,使生命活动得以正常进行。某些微生物在代谢过程中,除了产生其生命活动所必需的初级代谢产物和能量外,还会产生一些次级代谢产物。这些物质除有利于微生物生存,还与人类生产生活密切相关。代谢(metabolism):细胞内发生的各种化学反应的总称代谢分解代谢(catabolism)合成代谢(anabolism)复杂分子(有机物)分解代谢合成代谢简单小分子ATPH第一节 酶的基本知识第二节 能量

3、代谢第三节 大分子物质的降解第四节 微生物的发酵第五节 微生物代谢的调节和控制第六章 微生物的代谢 第一节 酶的基本知识微生物的代谢活动:酶类受多因素的调节和控制组合成有规律.有组织的酶系,完成复杂的代谢活动.酶是生物的催化剂-没有酶,微生物就没有生命,生命是不能离开酶而存在.酶的性质酶是生物催化剂2.酶具有高度催化效果3.酶具有高度专一性(1).绝对专一性(2).相对专一性(3).立体异构专一性4.酶的化学本质是蛋白质5.酶作用受到温度.PH.酶浓度激活剂.抑制剂等因素的影响二.酶的分类1.氧化还原酶类:-氧化酶.脱氢酶2.转移酶类:-催化化合物中某些基团的转移,即将一种分子上的某一基团转移

4、到另一种分子上去的反应.3. 水解酶类将有机大分子水解为简单的小分子化合物4.裂合酶类:催化一个化合物分解为几个化合物,逆反应也可5.异构酶类:催化同分异构化合物之间的相互转化,即分子内部基团的重新排列6.合成酶类催化两个化合物的结合,形成新的物质第二节 能量代谢分解代谢实际上是物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应,逐步分解并释放能量的过程,这个过程也称为生物氧化,是一个产能代谢过程。在生物氧化过程中释放的能量可被微生物直接利用,也可通过能量转换贮存在高能化合物(如ATP)中,以便逐步被利用,还有部分能量以热的形式被释放到环境中。不同类型微生物进行生物氧化所利用的物质是不同的,异养微生物

5、利用有机物,自养微生物则利用无机物,通过生物氧化来进行产能代谢。第二节 能量代谢 一.生物氧化的过程1.底物脱氢作用2.氢和电子的传递3.最后受氢体接受氢和电子生物氧化作用是在微生物细胞内酶的催化下,完成营养物质氧化的过程,也是生物体新陈代谢的重要基本反应。第二节 能量代谢能量代谢的中心任务是生物体如何把外界环境中多种形式的最初能源转换成对一切生命活动都能使用的通用能源 ATP 。对微生物来说,它们可利用的最初能源有三大类即:有机物、日光和还原态无机物。 二.生物氧化的类型1.好氧呼吸以分子氧作为最终电子受体的生物氧化过程.彻底氧化,放能最多。2.厌氧呼吸以无机氧化物作为最终电子受体有机化合物

6、.不需要氧气,放能多。3.发酵. 电子供体是有机化合物,而最终电子受体也是有机化合物的生物氧化过程不彻底氧化,放能最少。微生物类型是否需氧生物氧化类型实例好氧微生物 aerobe是有氧呼吸多数细菌全部的霉菌厌氧微生物 anaerobe否无氧呼吸或发酵作用肉毒梭菌破伤风梭菌兼性厌氧微生物facultative aerobe 兼性有氧呼吸和无氧呼吸或有氧呼吸和发酵作用酵母菌有关“鬼火”的生物学解释 在无氧条件下,某些微生物在没有氧、氮或硫作为呼吸作用的最终电子受体时,可以磷酸盐代替,其结果是生成磷化氢(PH3),一种易燃气体。当有机物腐败变质时,经常会发生这种情况。 若埋葬尸体的坟墓封口不严时,这

7、种气体就很易逸出。农村的墓地通常位于山坡上,埋葬着大量尸体。在夜晚,气体燃烧会发出绿幽幽的光。长期以来人们无法正确地解释这种现象,将其称之为“鬼火”。三.呼吸链微生物从呼吸底物脱下的氢和电子向最终电子受体的传递过程中,要经过一系列的中间传递体,并有顺序的进行,他们相互”连接”如同链条一样-呼吸链.也称为生物氧化链。四. ATP的生成ATP是微生物生命活动的能量来源.ATP的产生是电子从起始的电子供体经过呼吸链传至最终受体的结果.ATP是生物体内能量的主要传递者ATP的生成需要能量,这些能量来自光能及化学能。ATP和酶产生偶联作用即可利用,又可储存由光能生成ATP的过程称为光和磷酸化;以化学能生

8、成ATP的过程称为氧化磷酸化。光合磷酸化:利用光能合成ATP的反应。光合磷酸化作用将光能转变成化学能,以用于从二氧化碳合成细胞物质.主要是光合微生物。光合微生物:藻类、蓝细菌、光合细菌(包括紫色细菌、绿色细菌和嗜盐菌等)。 细菌的光合作用与高等植物不同的是,除蓝细菌具有叶绿素、能进行水的裂解进行产氧的光合作用外,其他细菌没有叶绿素,只有菌绿素或其他光合色素,只能裂解无机物(如H2、H2S等)或简单有机物,进行不产氧的光合作用。氧化磷酸化:利用化合物氧化过程中释放的能量生成ATP的反应。氧化磷酸化生成ATP的方式有两种:底物水平磷酸化不需氧电子传递磷酸化需氧。底物水平磷酸化: 底物水平磷酸化是在

9、某种化合物氧化过程中可生成一种含高能磷酸键的化合物,这个化合物通过相应的酶作用把高能键磷酸根转移给ADP,使其生成ATP。 这种类型的氧化磷酸化方式在生物代谢过程中较为普遍。催化底物水平磷酸化的酶存在于细胞质内。 在电子传递磷酸化中,通过呼吸链传递电子,将氧化过程中释放的能量和ADP的磷酸化偶联起来,形成ATP。 呼吸链中的电子传递体主要由各种辅基和辅酶组成,最重要的电子传递体是泛琨(即辅酶Q)和细胞色素系统。在不同种类的微生物中细胞色素的成员是不同的。 通过呼吸链生成的ATP数量主要是根据呼吸链成员的多少而不同,而呼吸链的组成因微生物种类而异,如酵母菌可生成3个ATP,而细菌大约只生成1个A

10、TP,磷酸化作用是在电子自供体向最终受体的传递过程中发生的。电子传递磷酸化ATP的生成ATP的生成方式: 微生物能量代谢活动中所涉及的主要是ATP(高能分子)形式的化学能. ATP是生物体内能量的载体或流通形式.当微生物获得能量后,都是先将获得的能量转换成ATP.当需要能量时,ATP分子上的高能键水解,重新释放出能量。光合磷酸化氧化磷酸化底物水平磷酸化电子传递磷酸化大分子物质的降解淀粉、脂肪、蛋白质、果胶质等胞外酶的作用葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等第三节. 大分子物质的降解第三节. 大分子物质的降解一. 多糖的分解(一). 淀粉的分解淀粉微生物碳源的原料淀粉-是葡萄糖的多聚物.淀粉-直链淀粉(20

11、%).支链淀粉(80%)微生物对淀粉的分解是由微生物分泌的淀粉酶催化进行.淀粉酶是水解淀粉糖苷键酶的总称.(一)淀粉的分解 淀粉是葡萄糖通过糖苷键连接而成的一种大分子物质。淀粉有两类,一类是由-1,4-糖苷键将葡萄糖连接而成的直链淀粉;另一类是在直链淀粉基础上,又产生由-1,6-糖苷键连接起来产生了分支的支链淀粉。一般在自然淀粉中,直链淀粉约占10%20%,支链淀粉约占80%90%。在以淀粉作为生长碳源与能源的微生物中,它们能利用本身合成并分泌到胞外的淀粉酶,将淀粉水解生成双糖与单糖后,被微生物吸收,然后再被分解与利用。分解淀粉的酶种类较多,而且作用方式各异,目前按作用方式与特点可将淀粉酶分为

12、几种类型。1.液化型淀粉酶(又称-淀粉酶)此酶作用的结果是产生麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。由于它作用的结果使原来淀粉溶液的黏度下降,并且产物的构型是-构型,故称为液化型淀粉酶或称-淀粉酶。在微生物中,许多细菌、放线菌和霉菌均能产生液化型淀粉酶,而且还可以通过工业发酵的方式来生产淀粉酶,枯草杆菌通常用作-淀粉酶的生产菌株。2.糖化型淀粉酶 这是一类酶的总称。它们的一个共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖,故名糖化型淀粉酶。目前已知这类酶至少包括下述三种:淀粉-1,4-麦芽糖苷酶(又称-淀粉酶)。故此酶作用于淀粉后的产物是麦芽糖与极限糊精;淀粉-1,4-葡萄糖苷酶。此酶作

13、用于直链淀粉后的产物几乎全是葡萄糖,作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖与带有-1,6-糖苷键的寡糖。根霉与曲霉普遍都能合成与分泌此酶;淀粉-1,6-糖苷酶(又称异淀粉酶)。此酶专门作用于淀粉分子中的-1,6-糖苷键,生成葡萄糖。(二)纤维素的分解纤维素是一种由葡萄糖通过糖苷键连接而成的大分子化合物。它的相对分子质量更大,更不溶于水,均不能直接被人和动物消化,但它可以被许多真菌包括木霉、青霉、曲霉、根霉以及放线菌与细菌中的一些酶分解与利用。细菌中常见的纤维素分解菌有黏细菌、梭状芽孢杆菌、瘤胃细菌、产琥珀酸拟杆菌、丁酸弧菌等。是葡萄糖由糖苷键组成的的大分子化合物,广泛存在于自然界中,是植物细胞壁的主要

14、成分.纤维素酶纤维素水解酶的总称. (三)果胶质的分解果胶是植物细胞的间隙物质,使临近细胞壁相连.在浆果中,果胶的含量最丰富.果胶酶分解果胶的酶的总称.果胶酶-广泛存在于植物.霉菌.细菌和酵母菌中.二.蛋白质.氨基酸的分解(一).蛋白质的分解蛋白质是由氨基酸组成的分子巨大结构复杂的化合物. 蛋白酶蛋白质 多肽或氨基酸 微生物对蛋白质的分解作用与人类的关系极为密切。土壤中含有的蛋白质物质,主要靠蛋白质分解菌分解,生成简单的含氮化合物,再供植物与微生物利用.在食品工业中,传统的酱制品,如酱油,豆豉、腐乳等的制作也都利用了微生物对蛋白质的分解作用。另一方面,微生物对蛋白质作用也对人类产生有害的作用,

15、如食物的腐败、伤口的感染、化脓等。目前已能利用枯草杆菌、栖土曲霉、放线菌等微生物来生产蛋白酶,用它来进行皮革脱毛、蚕丝脱胶等,满足皮革、纺织等领域工业的需要。 蛋白酶的分类:水解蛋白质的方式-内肽酶.端肽酶.蛋白酶的来源-动物.植物.微生物蛋白酶蛋白酶在体内在的位置-胃.胰.木瓜.菠萝蛋白酶等.蛋白酶作用的最适的PH-酸性.中性.硷性.蛋白酶的活性中心和最适作用PH,丝氨酸.巯基.金属.酸性蛋白酶等2.蛋白酶的生产菌种细菌.霉菌.放线菌等.1.脱氨作用 脱氨基主要有氧化脱氨基(大肠杆菌等参与)、水解脱氨基(酵母菌等参与)和还原脱氨基(大肠杆菌等参与)等几种方式。1.氧化脱氨基 CH3CHNH2

16、COOH+1/2O2CH3COCOOH+NH32.水解脱氨基 RCHNH2COOH+H2ORCH2OH+CO2+NH33.还原脱氨基 HOOCCH2CHNH2COOHHOOCCH=CHCOOH+NH3 (二).氨基酸的分解主要是脱氨作用.脱羧基作用.2. 脱羧基作用 许多微生物细胞体内通常都具有氨基酸脱羧酶,它可以催化氨基酸脱羧生成有机胺,有机胺在胺氧化酶的作用下,放出氨生成相应的醛,醛再氧化成有机酸,最后按脂肪酸-氧化的方式分解,为机体生长提供必要的能量与小分子化合物。微生物分解氨基酸的方式及产物的不同,常用来作为鉴定菌种的一个生理生化指标.第四节.微生物的发酵发酵(fermentation

17、)广义的“发酵”是指利用微生物生产有用代谢产物的一种生产方式;狭义的“发酵”是指在无外源电子受体的条件下,微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物,同时释放能量并产生各种不同代谢产物的过程。在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化,因此,只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原偶联在一起的。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢,即不需要外界提供电子受体。 在工业生产中常把好氧或兼性厌氧微生物在通气或厌气的条件下的产品生产过程统称为发酵。发酵(fermentation)发酵途径 发酵的种类有很多,可发酵的底物有糖类、有机酸、氨基酸等,其中以微生物发酵

18、葡萄糖最为重要。生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解,主要分为四种途径:EMP途径、HMP途径、ED途径、磷酸解酮酶途径.发酵类型 在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下,不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢产物。根据发酵产物不同,发酵的类型主要有乙醇发酵、乳酸发酵、丙酮丁醇发酵、混合酸发酵等。一. 由EMP途径进行的发酵 (一).EMP途径(糖酵解途径) 在无氧条件下,微生物利用葡萄糖发酵产生的有机酸.醇类.和CO2等物质,称为糖酵解途径.又称EMP途径. (二).由EMP途径进行的发酵1.乙醇发酵在酵母菌的乙醇发酵里,葡萄糖经过糖酵解作用产生两个丙酮酸,丙酮酸再

19、经脱羧、放出CO2生成乙醛,乙醛接受糖酵解过程中放出的氢而被还原成乙醇。因此在乙醇发酵过程中,一个葡萄糖最终转变成两个乙醇,放出两个CO2,同时净产生两个ATP:2. 乳酸发酵乳酸发酵:许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸,这类细菌称为乳酸细菌。根据产物的不同,乳酸发酵有三种类型:同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵:葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸,丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下被NADH还原为乳酸。由于终产物只有乳酸一种,故称为同型乳酸发酵。异型乳酸发酵:葡萄糖首先经PK途径分解,发酵终产物除乳酸以外还有一部分乙醇或乙酸。双歧发酵:是双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。 渍酸菜,南方泡菜

20、是常见的乳酸发酵。3. 丙酸发酵:许多厌氧菌可进行丙酸发酵。葡萄糖经EMP途径分解为两个丙酮酸后,再被转化为丙酸。少数丙酸细菌还能将乳酸(或利用葡萄糖分解而产生的乳酸)转变为丙酸。4. 混合酸发酵 许多微生物还能通过发酵将葡萄糖转变成琥珀酸、乳酸、甲酸、乙醇、乙酸、H2和CO2等多种代谢产物,由于代谢产物中含有多种有机酸,因此,将这种发酵称为混合酸发酵。5.丁酸发酵:发酵终产物为丁酸或丁醇和丙酮。6.丁二醇发酵(2,3-丁二醇发酵) 肠杆菌、沙雷氏菌、欧文氏菌等丙酮酸乙酰乳酸3-羟基丁酮乙二酰红色物质(乙酰乳酸脱氢酶)(OH-、O2)中性丁二醇精氨酸胍基其中两个重要的鉴定反应: 1 、VP实验

21、 2、甲基红(M.R)反应产气肠杆菌: V.P.试验(+),甲基红(-) E.coli: V.P.试验(-),甲基红(+)V.P.试验的原理:甲基红实验(M.R): 产气杆菌在发酵葡萄糖时,只有一小部分按混合酸发酵的类型进行外,大部分丙酮酸先通过两个分子的缩合成为乙酰乳酸,再脱羧成为3-羟基丁酮,然后再还原为2,3-丁二醇。丁二醇是中性的,而大肠杆菌的产物中有多种有机酸,发酵液中PH很低(4.5),甲基红实验(M.R)结果为大肠杆菌阳性(), 产气杆菌甲基红实验(M.R)结果为阴性()。V.P实验: 丁二醇发酵的中间产物-3-羟基丁酮是菌种鉴定的V.P实验的物质基础。3-羟基丁酮在碱性条件下被

22、空气中的氧气氧化成(双)乙二酰,它能与培养基成分蛋白胨中的精氨酸所含的胍基反应生成红色化合物。产气杆菌产生大量3-羟基丁酮,故V.P实验阳性();而大肠杆菌产生很少或不产生3-羟基丁酮,故V.P实验阴性()。 在饮水、食品的卫生学检验中对大肠杆菌和产气杆菌常用的鉴别指标: 大肠杆菌 产气杆菌 V.P实验 () () M.R实验 () () EMB培养基 紫黑色干燥的 湿润的灰棕色的 具有金属光泽 大菌落 的小菌落ATPADPATPADPADPATPADPATPNAD+ NADH+H+aa :预备性反应bb :氧化还原反应底物水平磷酸化底物水平磷酸化EMP途径(Embden-Meyerhof p

23、athway)EMP途径意义:为细胞生命活动提供ATP 和 NADH葡萄糖葡糖-6-磷酸果糖-6-磷酸果糖-1,6- 二磷酸磷酸二羟丙酮甘油醛-3-磷酸1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸EMP途径关键步骤1. 葡萄糖磷酸化1.6二磷酸果糖(耗能)2. 1.6二磷酸果糖2分子3-磷酸甘油醛3. 3-磷酸甘油醛丙酮酸总反应式:葡萄糖+2NAD+2Pi+2ADP 2丙酮酸+2NADH2+2ATP CoA 丙酮酸脱氢酶 乙酰CoA, 进入TCA二. 由HMP 途径进行的发酵(一).HMP 途径微生物在利用葡萄糖分解代谢过程中,由磷酸已糖开始分解,形成5C物;5C物再

24、分解成3C物和 2C物; 3C物和 2C物又继续进行代谢生成乳酸等产物.- HMP 途径分为两个阶段:1、3个分子6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶等催化下经氧化脱羧生成6个分子NADPH+H+,3个分子CO2和3个分子5-磷酸核酮糖2、5-磷酸核酮糖在转酮酶和转醛酶催化下使部分碳链进行相互转换,经三碳、四碳、七碳和磷酸酯等,最终生成2分子6-磷酸果糖和1分子3-磷酸甘油醛。(二). HMP 途径进行的发酵6-磷酸果糖出路:可被转变重新形成6-磷酸葡糖,回到磷酸戊糖途径。甘油醛-3-磷酸出路: a、经EMP途径,转化成丙酮酸,进入TCA 途径 b、变成己糖磷酸,回到磷

25、酸戊糖途径。总反应式:6 6-磷酸葡萄糖+12NADP+3H2O 5 6-磷酸葡萄糖 + 6CO2+12NADPH+12H+Pi 特点:a 、不经EMP途径和TCA循环而得到彻底氧化,无ATP生成, b、产大量的NADPH+H+还原力 ;c、产各种不同长度的重要的中间物(5-磷酸核糖、4-磷酸-赤藓糖 )d、单独HMP途径较少,一般与EMP途径同存 e、HMP途径是戊糖代谢的主要途径。 三.由TCA循环进行的发酵(一). TCA循环 许多好氧和兼性厌氧微生物都能通过TCA途径进行发酵,在一定条件下,生成许多产物,微生物利用葡萄糖,经过EMP途径生成丙酮酸,在无氧条件下还原成乙醇.乳酸等发酵产物

26、. 但在有氧条件下,丙酮酸经过循环代谢途径,不断被分解,最终被彻底氧化成CO2和H2O,并释放出大量能量.在这个循环代谢途径中,由于有几个中间产物是含3个羧基的化合物-三羧酸循环 丙酮酸在进入三羧酸循环之先要脱羧生成乙酰CoA,乙酰CoA和草酰乙酸缩合成柠檬酸再进入三羧酸循环。循环的结果是乙酰CoA被彻底氧化成CO2和H2O,每氧化1分子的乙酰CoA可产生12分子的ATP,草酰乙酸参与反应而本身并不消耗。TCA循环的重要特点1、循环一次的结果是乙酰CoA的乙酰基被氧化为2分子CO2,并重新生成1分子草酰乙酸;2、整个循环有四步氧化还原反应,其中三步反应中将NAD+还原为NADH+H+,另一步为

27、FAD还原;3、为糖、脂、蛋白质三大物质转化中心枢纽。4、循环中的某些中间产物是一些重要物质生物合成的前体;5、生物体提供能量的主要形式;6、为人类利用生物发酵生产所需产品提供主要的代谢途径。如柠檬酸发酵;Glu发酵等。TCA循环的生理意义:(1)为细胞提供能量。(2)三羧酸循环是微生物细胞内各种能源物质彻底氧化的共同代谢途径。 (3)三羧酸循环是物质转化的枢纽。 TCA循环柠檬酸循环或Krebs循环 四. 由ED途径进行的发酵(一). ED途径:四. ED途径 2-酮-3-脱氧-6-磷酸-葡萄糖酸裂解途径 1952年 Entner-Doudoroff :嗜糖假单胞 (二) 由ED途径进行的发

28、酵 过程: (4步反应) 1 葡萄糖 6-磷酸-葡萄糖 6-磷酸-葡糖酸 KDPG6-磷酸-葡萄糖-脱水酶3-磷酸-甘油醛 + 丙酮酸KDPG醛缩酶特点: a、步骤简单 b、产能效率低:1 ATP c、关键中间产物 KDPG,特征酶:KDPG醛缩酶 细菌:铜绿、荧光假单胞菌,根瘤菌,固氮菌,农杆菌,运动发酵单胞菌等。第五节微生物代谢的调节与控制 一 酶合成的调节 二 酶活性的调节微生物代谢调节系统的特点:精确、可塑性强,细胞水平的代谢调节能力超过高等生物。微生物细胞代谢的调节主要是通过控制酶的作用来实现的 调节类型酶合成调节 酶活性调节 调节的是已有酶分子的活性,是在酶化学水平上发生的 调节的

29、是酶分子的合成量,是在遗传学水平上发生的 原核基因的表达调控一、酶合成的调节 酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制,这是一种在基因水平上(在原核生物中主要在转录水平上)的代谢调节。凡能促进酶生物合成的现象,称为诱导。能阻碍酶生物合成的现象,则称为阻遏。与上述调节酶活性的反馈抑制等相比,调节酶的合成(即产酶量)而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。其优点则是通过阻止酶的过量合成,有利于节约生物合成的原料和能量。在正常代谢途径中,酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。 (一)酶合成调节的类型 1诱导根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物

30、或其有关物的关系,可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。 诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物,它可以是该酶的底物,也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。 组成酶(固有酶):不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如:EMP途径的一些酶。诱导酶:依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如:乳糖酶。 酶的诱导合成类型同时诱导,即当诱导物加入后,微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成,它主要存在于短的代谢途径中。例如,将乳糖加入到Ecoli培养基中后,即可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成;顺序诱导,

31、即先合成能分解底物的酶,再依次合成分解各中间代谢物的酶,以达到对较复杂代谢途径的分段调节。2阻遏 在微生物的代谢过程中,当代谢途径中某末端产物过量时,除可用前述的反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外,还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成,从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。 (1)末端产物阻遏指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说,末端产物阻遏的情况较为简单,即产物作用于代谢途径中的各种酶,使之合成受阻遏。

32、对分支代谢途径来说,情况就较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏,此即称多价阻遏作用。末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用,它可保证细胞内各种物质维持适当的浓度。(2)分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物(碳源或氮源)存在时,利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。因此,分解代谢物的阻遏作用,就是指代谢反应链中,某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。(二)酶合成调节的机制 (1)操纵子: 指的是一组功能上相关的基因,它是由启动基因、操纵基因和结构基因三部分组成

33、。启动基因-是一种能被依赖于DNA的RNA多聚酶所识别的碱基顺序,它既是RNA多聚酶的结合部位,也是转录的起始点;操纵基因-是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序,能与阻遏物(一种调节蛋白)相结合,以此来决定结构基因的转录是否能进行;操纵子分两类:一类是诱导型操纵子,只有当存在诱导物(一种效应物)时,其转录频率才最高,并随之转译出大量诱导酶,出现诱导现象。另一类是阻遏型操纵子,只有当缺乏辅阻遏物(一种效应物)时,其转录频率才最高。由阻遏型操纵子所编码的酶的合成,只有通过去阻遏作用才能起动。 结构基因-则是决定某一多肽的DNA模板,可根据其上的碱基顺序转录出对应的mRNA,然后再可通过核糖体

34、而转译出相应的酶。一个操纵子的转录,就合成了一个mRNA分子。(2)调节基因 用于编码组成型调节蛋白的基因。调节基因一般位于相应操纵子的附近。(3)效应物 是一类低分子量的信号物质(如糖类及其衍生物、氨基酸和核苷酸等),包括诱导物和辅阻遏物两种,它们可与调节蛋白相结合以使后者发生变构作用,并进一步提高或降低与操纵基因的结合能力。(4)调节蛋白 是一类变构蛋白,它有两个特殊位点,其一可与操纵基因结合,另一位点则可与效应物相结合。当调节蛋白与效应物结合后,就发生变构作用。有的调节蛋白在其变构后可提高与操纵基因的结合能力,有的则会降低其结合能力。调节蛋白可分两种,其一称阻遏物,它能在没有诱导物(效应

35、物的一种)时与操纵基因相结合;另一则称阻遏物蛋白,它只能在辅阻遏物(效应物的另一种)存在时才能与操纵基因相结合。负调节正调节 通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。是酶分子水平上的调节,属于精细的调节。 调节方式:包括两个方面:1、酶活性的激活:在代谢途径中后面的反应可被较前面的反应产物所促进的现象;常见于分解代谢途径。 如:粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进2、酶活性的抑制:包括:竞争性抑制和反馈抑制。概念:反馈:指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。 凡使反应速度加快的称正反馈; 凡使反应速度减慢的称负反馈(反馈抑制); 反馈抑制主要表现在某代

36、谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。 特点:作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除二 酶活性的调节酶活性调节 酶活性调节是指一定数量的酶,通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。这种调节方式可以使微生物细胞对环境变化作出迅速地反应。酶活性调节受多种因素影响,底物的性质和浓度,环境因子,以及其它酶的存在都有可能激活或控制酶的活性。1.变构调节 在某些重要的生化反应中,反应产物的积累往往会抑制催化这个反应的酶的活性,这是由于反应产物与酶的结合抑制了底物与酶活性中心的结合。在一个由多步反应组成的代谢途径中,末端产物通

37、常会反馈抑制该途径的第一个酶,这种酶通常被称为变构酶(allosteric enzyme)。 末端产物对酶活的反馈抑制 i u v w z U V W X中间产物末端Z产物反 馈 抑 制变构酶理论: 变构酶为一种变构蛋白,酶分子空间构象的变化 影响酶活。其上具有两个以上立体专一性不同的接受部位,一个是活性中心,另一个是调节中心。活性位点: 与底物结合变构位点:与抑制剂结合,构象变化,不能与底物结合 与激活剂结合, 构象变化,促进与底物结合 2. 修饰调节 修饰调节是通过共价调节酶来实现的。共价调节酶通过修饰酶催化其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰,使之处于活性和非活性的互变状态,从而导致调节

38、酶的活化或抑制,以控制代谢的速度和方向。3.分支合成途径调节共同特点:每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶,同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用,分支代谢的反馈调节方式有多种。1.同功酶同功酶是指能催化同一种化学反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。特点:在分支途径中的第一个酶有几种结构不同的一组同功酶,每一种代谢终产物只对一种同功酶具有反馈抑制作用,只有当几种终产物同时过量时,才能完全阻止反应的进行。这种调节方式的著名的例子是大肠杆菌天门冬氨酸族氨基酸的合成。有三个天门冬氨酸激酶催化途径的第一个反应,分别受赖氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸的调节。 2. 协同

39、反馈抑制 协同反馈抑制:在分支代谢途径中,几种末端产物同时都过量,才对途径中的第一个酶具有抑制作用。若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。例如,在多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)合成赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的途径中,终点产物苏氨酸和赖氨酸协同抑制天门冬氨酸激酶。 3. 累积反馈抑制累积反馈抑制:在分支代谢途径中,任何一种末端产物过量时都能对共同途径中的第一个酶起抑制作用,而且各种末端产物的抑制作用互不干扰。当各种末端产物同时过量时,它们的抑制作用是累加的。如果末端产物H单独过量时,抑制AB酶活性的40%,剩余酶活性为60%,如果末端产物Z单独过量时抑制AB酶活性

40、的30%,当HZ同时过量时,其抑制活性为:40%+(1-40%)30%=58%。累积反馈抑制最早是在大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶的调节过程中发现的,该酶受8个最终产物的积累反馈抑制。4. 顺序反馈抑制顺序反馈抑制:分支代谢途径中的两个末端产物,不能直接抑制代谢途径中的第一个酶,而是分别抑制分支点后的反应步骤,造成分支点上中间产物的积累,这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。因此,只有当两个末端产物都过量时,才能对途径中的第一个酶起到抑制作用。枯草芽孢杆菌合成芳香族氨基酸的代谢途径就采取这种方式进行调节。 5.合作反馈抑制定义:两种末端产物同时存在时,共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。

41、举例:在嘌呤核苷酸合成中,磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP (和IMP)的合作反馈抑制,二者共同存在时,可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时,分别抑制其活性的70%和10%。6.优先合成 在分支合成途径中,分支点后的两种酶竞争同一种底物,如AMP与GMP,Thr与Lys、Met,由于两种酶对底物的Km值(即对底物的亲和力)不同,故两条支路的一条优先合成。 第六节 微生物次级代谢与次级代谢产物 一、次级代谢与次级代谢产物 一般将微生物通过代谢活动所产生的自身繁殖所必需的物质和能量的过程,称为初级代谢,该过程所产生的产物即为初级代谢产物,如氨基酸、核苷类,以及酶或辅酶等。 次级代谢是指微生物在

42、一定的生长时期,以初级代谢产物为前体,合成一些对于该微生物没有明显的生理功能且非其生长和繁殖所必需的物质的过程。这一过程的产物,即为次级代谢产物,如抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等。 次级代谢与初级代谢关系密切,初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体,比如糖降解过程中的乙酰-CoA是合成四环素、红霉素的前体;一般菌体的次级代谢在对数生长后期或稳定期间进行,受环境条件的影响; 次级代谢产物在微生物生命活动过程中的产生极其微量,对微生物本身的生命活动没有明显作用,当次级代谢途径被阻断时,菌体生长繁殖仍不会受到影响,因此,它们没有一般性的生理功能,也不是生物体生长繁殖的必需物质,但对其它生

43、物体往往具有不同的生理活性作用,因此,人们利用这些具有各种生理活性的次级代谢产物生产具有应用价值的药物。 二、次级代谢的调节1初级代谢对次级代谢的调节 次级代谢与初级代谢类似,它在调节过程中也有酶活性的激活和抑制及酶合成的诱导和阻遏。 2含氮化合物对次级代谢的调节作用 菌体内的谷氨酰胺合成酶(GS)的水平与抗生素的产量间呈正相关性,丙氨酸脱氢酶(ADH)水平与利福霉素SV合成则呈负的相关性,而ADH和GS同化氨途径受培养基中氨浓度的调节,因此,氨浓度的调节影响抗生素的产量。 3诱导作用及产物的反馈抑制 三、微生物次级代谢与初级代谢及生物合成抗生素的关系 1从菌体生化代谢方面分析许多抗生素的基本

44、结构是由少数几种初级代谢产物构成的,所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的,次级代谢途径并不是独立的,而是与初级代谢途径有密切关系的。糖代谢中间体,既可用来合成初级代谢产物,又可用来合成次级代谢产物,这种中间体叫做分支中间体。2、遗传代谢方面分析 初级代谢与次级代谢同样都受到核内DNA的调节控制,而次级代谢产物还受到与初级代谢产物生物合成无关的遗传物质的控制,即受核内遗传物质(染色体遗传物质)和核外遗传物质(质体)的控制。有一部分代谢产物的形成,取决于由质体信息产生的酶所控制的代谢途径,这类物质称为质体产物。 由于这类物质的形成直接或间接受质体遗传物质的控制,因而产生了质体遗传的观点

45、。 也有只由染色体DNA控制的抗生素产物。抗生素产生菌的主要代谢调节机制受DNA控制的酶合成的调节机制,包括酶的诱导和酶的阻遏(有终点产物的阻遏和分解产物的阻遏)。酶活性的调节机制,包括终点产物的抑制或活化,利用辅酶的酶活调节、酶原的活化和潜酶的活化。细胞膜透性的调节。一、微生物代谢产物的利用利用微生物代谢过程中产生的众多代谢产物生产各种发酵产品。按照积累产物类型: 初级代谢产物,如氨基酸、核苷类,以及酶或辅酶; 次级代谢产物,抗生素、激素、生物碱、毒素及维生 素等。按照发酵类型: 自然发酵:酒精、乳酸等, 代谢控制发酵:终端产物,赖氨酸、鸟苷酸、腺苷酸等; 中间产物,柠檬酸、-酮戊二酸、琥珀

46、酸、 高丝氨酸、肌苷酸、黄苷酸等;第七节 微生物代谢与生产实践 1发酵条件的控制人们通过对微生物菌种营养和培养条件的控制生产所要的目的产品:1)培养条件:温度、pH值、渗透压的控制;2)营养成分的控制:葡萄糖浓度、碳氮比、生长因子、无机离子等;3)溶解氧的控制:通气量,搅拌等。2代谢调节的控制(1)应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节 赖氨酸发酵(高丝氨酸缺陷型菌株)在这个代谢工程的设计中,是利用阻断分支途径的高丝氨酸的合成,来解除(Lys+Thr)的反馈调节。即造成高丝氨酸缺陷型(Hser一),就可解除末端产物对限速酶的反馈抑制。天冬氨酸人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸中间产物天冬氨

47、酸激酶中间产物甲硫氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶不能合成可以大量积累赖 氨 酸人工诱变的菌种不能产生选育细胞膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型,或生物素缺陷型 利用油酸缺陷型菌株,限量添加油酸,限制细胞膜磷脂中不饱和脂肪酸的合成而使细胞膜缺损,利于代谢产物渗漏而提高谷氨酸的产量。生物素缺陷型原理 在脂肪酸生物合成途径中,由乙酰辅酶A羧化成丙二酸单酰辅酶A的反应是一个限速步骤,该反应由乙酰辅酶A羧化酶系催化,包括生物素羧化酶,羧基转移酶和生物素羧基载体蛋白CCP,并且需要生物素作辅酶。选育生物素营养缺陷型菌株,使细胞中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的合成受阻,从而影响到磷脂的合成。在培养时限量添

48、加生物素或含生物素的原料,可以控制膜的厚度来调节透性。(2)应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节抗反馈调节突变菌株,就是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株,或兼而有之的菌株。在这类菌株中,因其反馈抑制或阻遏已解除,或是反馈抑制和阻遏已同时解除,所以能分泌大量的末端代谢产物。如Corynebacteriumcrenatum(钝齿棒杆菌)的抗-氨基-羟基戊酸(AHV)菌株能积累积苏氨酸。(3)控制细胞膜的透性生理学方法:生物素是乙酰CoA羧化酶的辅基,可羧化乙酰CoA生成丙二酸单酰CoA,进而合成膜磷脂的主要成分脂肪酸。因此,当生物素浓度亚适量时,膜透性有利于谷氨酸的分泌。含量高,膜结

49、构致密,不利分泌。添加适量青霉素,使肽桥无法交联,壁缺损,膨压下,有利外渗,降低浓度的反馈抑制,提高产量。(3)控制细胞膜的透性遗传学方法:油酸(十八碳一烯酸)是膜磷脂的重要脂肪酸。突变为油酸缺陷型后,不能自身合成油酸,使细胞膜缺损。通过限量添加油酸,控制缺损程度,使渗漏适当,从而提高产量。3微生物代谢与代谢工程 近年来,基因工程的不断发展,也为微生物代谢在发酵生产的应用提供了新的方法。 人们通过分子生物学技术和DNA重组技术, 可以定向地对细胞代谢途径进行修饰或引入新的反应,以改进产物的生成或改变细胞的代谢特性。但这些改进都是与微生物的基因调控和代谢调控及生化工程相结合来实现的。 利用DNA

50、重组技术改变微生物代谢流,扩展和构建新的代谢途径,或通过关联酶将两个代谢途径连接形成新的的代谢流的研究,取得了令人瞩目的进展。克隆来自细菌的木糖异构酶基因,克隆来自柄状毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因。引入木糖代谢途径(戊糖代谢生产乙醇的代谢工程) 酵母菌Saccharomyces的代谢工程 二、微生物代谢活性的利用 1生物转化 生物转化是指利用生物体代谢过程中产生的酶使底物进行有机反应。生物转化一般采用微生物细胞或微生物酶作催化剂,故又称作微生物转化。 微生物转化的一个重要领域是手性化合物的合成与拆分。 主要应用在药物、香料,杀虫剂、杀菌剂,除草剂,昆

51、虫激素等方面。如,光学活性的R-和L-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(R-和S-CHBE)是制备各种光学活性化合物的基本原料,如L-肉毒碱(R-型),3-羟基-3甲基戊二酰( HMG)-CoA-还原酶抑制剂和1,4-二氢吡啶-型的-阻断剂(L-型)。 2微生物降解秸杆 秸秆成分中的纤维素和半纤维素能够被草食动物的瘤胃微生物充分降解利用,但由于木质素和纤维素之间镶嵌在一起形成坚固的酯键,阻碍了瘤胃微生物对纤维素的降解,导致秸秆消化率低。因此提高秸秆消化率的关键是降解木质素,打断酯键。 英国Aston大学最近从秸秆堆中分离出一种白腐真菌,这种微生物只降解木质素,不降解纤维素,用作处理秸秆,可使秸秆的体外

52、消化率从19.63%提高到41.13%。 白腐真菌分解木质素的机理是:在适宜的条件下,白腐真菌的菌丝首先用其分泌的超纤维氧化酶溶解表面的蜡质,然后菌丝进入秸秆内部,并产生纤维素酶、半纤维素酶、内切聚糖酶、外切聚糖酶,降解秸秆中的木质素和纤维素,使其成为含有酶的糖类,从而使秸秆变得香甜可口,易于消化吸收。3微生物冶金、采油 人类利用具有氧化硫化物矿中的硫和硫化物能力的微生物将硫化矿中的重金属通过转化成高度水溶性的重金属硫酸盐而从低品位矿中浸出来生产黄金。 如,氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferooxidans)的氧化作用可从金矿石中除去硫、砷,浸提黄金,如果用化学方法浸提金的话,其

53、得率不到70; 俄罗斯科学家使用多种适于在石油中生存的微生物,将其与催化剂一同置于采油管内,这些微生物新陈代谢的产物可以大大增强石油的流动性,从而提高采油率,而不会影响石油的质量。 4生物降解 迄今为止,已知的环境污染物达数十万种之多,其中大量的是有机物。由于微生物的代谢类型极其多样,作为一个整体,微生物分解有机物的能力是惊人的。可以说,凡自然界存在的有机物,几乎都能被微生物所分解。 我们可从中筛选出一些污染物的高效降解菌。更可利用这一原理定向驯化、选出污染物的高效降解菌,以使不可降解的或难降解的污染物,转变为能降解的,甚至能使它们迅速、高效地去除。 突破微生物的自我代谢调节机制,使代谢产物积累的有效措施有三种:应用营养缺陷型菌株,利用其合成代谢途径中某一步发生的缺陷,解除反馈调节作用,

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