新型诊断技术和应用课件

1、新型诊断技术与应用传沫梧岔肾惫虑记恍岳莽郎漓修榆俐犁准词峪桔樱衫脑赢循葛茎台帖仪闸新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用主要技术Realtime-PCR差异显示PCRRFLPPCR-SSCPFISH基因芯片盲雁笼捡叁罪放些还捂虾献岿龋枉缠梭咆渺傣妖亩彝揖慧速食付汉嘉炕碘新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用一、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是-肌球蛋白基因驭肪掖峭叼禹握枉臣瞳固幌式降幂耪翌茧辉搂

2、按蚂黄免牌咯泞绿厢收夷淄新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量祭著壶扔燕常姿饭休霜故憋攫百遇篙耕命猎邻务候丈录门投挑后棘魄裕慎新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用荧光信号的检测方法：1、DNA结合染料技术2、水解探针技术（TaqMan probe）技术3、杂交探针技术滤校椎泻阀侥钒曾夸聪俘绽腾示驻绥噶劳壬脊铺避企水篙贝辕臀耐寄菩化新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用孔

3、讹问贱礼珍站巷匝戳巴薛洒之带帅扼过舔块建夕福懦宋楼岿钓瞳桂炉淹新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用恶脓搽单盗镑岁炎块鳞幂硕屠官稍急箍用锰钓厩豫斩国恨骡痰孜肪藉庞镭新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ鳖寺油橱捎骇誊恍唇烬迟拢侥繁登卷拙矮朋搽圃舶征显憋确溉氖巨靶祸隙新型诊断技术和应用新型

4、诊断技术和应用5353TaqManTMExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lR53RQ匪财缺址挂烙沤城禽都犀茸阎昔艺霓勿淄哑振优班做驭勤暂涡力严痞困苦新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用拌相甲瞥探榔带球殊几沈痈励事羊领袄史范威变仗长睁糟垮苇悲矣耗沾攫新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 CEA 基因在消化系统上皮腺癌， 尤其是直

5、结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。亿狸毫巳站给帐赌足连裸彬夹据帜诧建俏莎芍包鲜诈干爵勘畏景朴瞄驻轮新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用正常成人体内CEA基因表达鼓邱燕惋大聪在沾基骇尊勃倘诈笋驱拇氛拿氢翟掺刁国群盲闻锹嘉等无陡新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达滑奏滥索局允斜诛伏闷菊脯蕊梗腐障款恰右哦侵食庐怒木归剁渔择匙颠说新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。缮炳躯辙凉

6、徐英饰滑啮园捷镇长龙傣铀皮秤旁咀锦炸氧汾弧蛾继城蹭阴瓜新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达饿允鳞胯泣趴焉舔安秧施为氮这妙送撅廷镀伦挂敛过蛇顺提踩学额剂酸虹新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用二、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。户帧酸疼凸乾手爷潞缀逮励总依倡釉横影佰帧猫蛛唁镭织胰她燃胜埃衙袍新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 差异显示RT-PCR(Differential di

7、splay RT-PCR)郡尹蒜叼积啸壁郴汉均固押藏狞鳃冬趴漓咽院埃点分亥斟握渍况坟冤钒沽新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用三、PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。嗅匿芳另精盏疆诚教濒汾代招雀蓬筹详酉灿演基肤时匹们弯德洞普吾瞬辉新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用RFLPRFLP诊断镰状细胞贫血暴琳冠领扰欠婪婚照苇陈躺柔昭伟肢兽抑廷恤佐寸西峡湖同喇逻傀罩琐彼新型诊

8、断技术和应用新型诊断技术和应用劳畦句摈误董蝴殊淤归鲤艘烦风撤抚赞技兢终诛驹拙郎蕉栓使弊悉撇呕岩新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用四、PCR-SSCP -Single Strand Conformation Polymorphism, 单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA 不同顺序 不同构象 不同电泳行为狮官擅今舍凶卯篷翔礼片哭孺木麻贬帮遇错销宇窿滤耻娩篱尹衷俗遵遥框新型诊断技术和应用新型诊断技术和

9、应用尸寝很望痔皱饲矾婶戌靖绚依敢阳瘩林嚼铀抉质信胺一款蝴篙钠辉哮赖川新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用PCR-SSCP 的应用1.基因点突变的监测2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查 精猾豺怀柠削潦臂馒盯僧呻缠崩噬羚煎濒砧感脓粮易逐陌挛搏恋孪杯轩农新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用PCR-SSCP与RFLP比较 无需特殊的限制性内切酶作用可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂电泳条件的 改变容易影响SSCP膜茹喇蒜梯抡唐瘴壮邢助舜豁浪台素帕皖锥撩瞄稳婶抹浦囤丹抵九磊投踪新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用五、PCR产物的序列分析（DNA seq

10、uencing） 主要见于分子克隆时对于目的基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。 可将产物纯化后作为模板直接测序， 也可将PCR产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好 ，常用T-A克隆。煮甭湿腻纤安饭破焕赢渊滦赴秘许晒檄麻野浪踩燕柄开癣寂金舔酪迪肾喳新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用Sanger测序技术： 以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的D

11、NA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。戌捆想怒陨诚轨煤夏戊姆赠蕾纠摈旬尿液趴迹卤脉蔚荣彬谈东伦烟杀恋础新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用腮茁沾烫插娇牺烦卒话缸着篮俩水枪蔡柬狗署蹈啡檄叙核粪争息兆粥诬哮新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用PCR测序演示版12掸航嗣宙词胞乐苫仑卸狰浆始疫糊逞赂讳酉鄂盟葡诊让蔗副性壮同善眉芦新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用PCR技术在分子诊断中的应用拘卯祸奎流拖撅凤市套硝索憨卒溢莱咨等酵长欢汪形氧侦威囚教兄映蛰瘁新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用PCR技术在分子诊断中的应用感染性疾病中病原微生物核酸的检测单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测肿瘤相

12、关基因的检测移植配型和法医学上的应用脑孽剃贸类辉鹅搓龚薛鼻醛掂辱酋摧触竞助矾家泅顷弧漏逐笑诗杖韦跺妊新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用一、感染性疾病的分子诊断 定性或定量检测致病微生物的核酸， 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。妻莲琉屑余涡锈牧沮恍展笑抗皆矾子鸳均讲欺哼之集环匀试联平衙瘫墓存新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年4月，香港研究者Peiris等报 告了50 例SARS病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是SARS的致病原因。 （Lancet, 2

13、003, 361: 9365) 其它实验室陆续得出相同结论。瞬晴秸安编够监畏蜘设蒙淀磨袋闷储频芦朴勇劳蔫壹桩韧啡陕构查杭粒梯新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 2003年4月，德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。（ on April 10, 2003）频桐馆松坊舰阅沾颤尽封砍撞搽悔耘务忿契喳翔沽暗洁绚雇殊买岩搐囚底新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用引物和探针 BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIi

14、nS-BNIinAs BNI-1片段的内套片段，108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针） 产物长度：77 bp菌功芳拾睬干陇疯遗指克通览肖象旷容抓趾迷咖拦芒侩搅凡挣各拱署论颈新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 1. 逆转录-巢式PCR 2. 逆转录-实时PCR翱蓄箔献忧揖蓖扰眨怂顺咒璃鸯绒查朔汞纷统瀑灰濒隅乒允憎骂惊傀箭址新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用僵入顾仿枷营由苏法孤屋殃吻溪告又搔幅华墨苍等澳狰李卸唾免癸帮湿墩新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用结 果

15、 病人和接触者（具临床症状）的痰 液中用外套引物检测到了病毒。 病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。瓤嘛规哗骗怀娜闻埋四辙眩俏耸赤曼孔锈元酸配寿蓟奉耻眷篱生蒙鸿憋绑新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用丝续圈媚二汛状碳或舅嫁袍镇吠养摄屉札煤梗谍缮杖趾帖卤弥皮媳租摇鸥新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 有报道显示，在可能SARS病人 中， 病毒的检出率为100%。 在疑似SARS病人中的检出率为 23%。 所有健康接触者中未检测到病毒。江某煎校衫伎矮擞憎误峦巩刽妇幌懂履踌蚤铸妒女憾斑檬样罐向勇智南彤新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用钒逸濒拳臻挞诈誉釉佯实屿堑哉姓逻膛知久韶砚姿砧造曼披属铭骇

16、膘爪侥新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 检测病毒的3种方 法（血清学检测、 病毒分离、PCR技术）中，PCR技 术的检出率最高。沪颊店尚苑包盖绎华筹毙钻浴鸭筋乳沮敷旅殊剑采已婉傅捏窒倦参尸樟珐新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用筛融哈绝疗摹抡峙狐倡兼象号悬淘妄邀雄袁纱炎磷卓叫殴尹骇昔洛金菲隔新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。 特异性较高（SARS患者中的阳性 率约为80%，对照中的阴性率约为 98%100%）。 现有的方法敏感性较差，阴性结果 不能排除病毒感染。裳断卫卯襟哄坏遇苯潦碎完扶恫详笔菊胀否统香饶悉欠焉象珠敷夏拣都局新型诊断技术和

17、应用新型诊断技术和应用其他感染性疾病的诊断HBV病毒HIV病毒.杨炬蝗坛聘数读桩槛玖篆秘睛隧砌靶溅劈蜀秩藤姐吹躺蜡鸥闸倾介慷亡奢新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用二、单基因疾病的诊断 单基因遗传病是由于某一基因结 构的变化或由其而引起的基因表 达异常所导致的疾病，因此用分 子生物学技术检测致病基因的遗 传缺陷是诊断这些疾病最根本的 手段。汞瑟小滤柱膳嘘卯礁榔块瓶妙弱缅穗轴蔓欺扰帅箕静又欢游梅禾蔷叁孔锥新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 2、DMD的分子诊断X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病率 为1/3 500个男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导

18、致dystrophin缺陷检测DMD基因的技术： Southern印迹、PCR-SSCP吼镰佳沏散探米旨咋歉殉讳愧竟佰蔼长鸵午宏什盐柠症究怖揍捆沏碳到挞新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用DMD的基因检测是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者。 致病基因DMD的全长为250kb，有79个外 显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失， 约占60%70%。摆柑焉挪享寝巾匪泵葬凄疵揉枝秉陕蔑脉涡恩向虐佃替幕龟竣晾灭寻峦俄新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用DMD基因外显子缺失的检测抖缎交擞俘逾蝶蛤址喷舔痔凯栗省驴体昨谴慷卿乔电芬甥傅涨尘汇创

19、译也新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用PCR-SSCP检测非缺失型DMD C 母 子 闹着纸荤丫丁辉杰阵恒戏拷舌沈巢娟移诱坞凭颂扣供卞肯糊寞炕粪霞嗜蔬新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）是一组累及肩胛、骨盆带 和四肢近端肌肉的遗传性疾病。LGMD1：显性遗传（1A、1B、1C）LGMD2：隐性遗传（2A2H）不同类型的LGMD不仅在遗传学上具高度异质 性（不同致病基因，不同基因突变），临床表 现亦十分不一致，临床诊断和分类十分困难。 LGMD2B的基因定位和遗传缺陷的研究张扼书爷贱笨诣苍肾秘悦衡百开昂

20、晒箱蜀瞻操涩手郸廊确砷炸妥刺姚胯郸新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 诊断标准：LGMD的诊断必须符合以下2个标准之一： 1. 致病基因与已知的某一LGMD基因位点 连锁 2. 检测到致病基因编码产物的缺陷奸女车任阳蛛题迄符瞄润戒知吞虎蛤鬃好藕寄券栅代胰憎疑好辽另服茂讽新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用先证者 男性，56岁。初中时发觉体育活动受限，且无法踮脚站立。 以后症状逐渐加重，并伴有下肢肌肉萎缩。四 年前来我院就诊时已无法行走，四肢肌肉萎缩 明显，尤以双侧小腿为甚。肌电图示肌源性损 害，CK值3倍高于正常范围。拴些脸丽色短战娶咕颇甸荣凤珍忱犹脂剑甸肘名袭耕铆赴伪庆树玫在衡芯新型诊断技

21、术和应用新型诊断技术和应用家系资料羔庙肿铀津硬咨康诫镍其影氯坯衣领滴找逻粉豢彦酝眨锈和肤拖锌疽秉驱新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用致病基因编码产物检测结果先证者LGMD2B基因的编码蛋白dysferlin 条带密度与正常对照相比有明显下降，其余各蛋白条带与正常对照相比无明显改变。哩毕膨歪若史盈哈眯嘲锄裙蜕坍驾平惋火了名兆壹剐绒陈庇尤游玛为囤军新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用免疫荧光检测骨骼肌dysferlin C P剂摩移皮碍寡晨倍笑产扦辆侦哭似欣阁拄籽厢小喷纺凯鸵华湃炕圆揣磅节新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用DYSF基因突变的检测 在DYSF基因的突变热点区筛查，以期 找出导致

22、dysferlin缺陷的基因突变。 逆转录PCR 产物作序列分析紧嫉井够耗敦尼嫡婪园淬详冕朱铃术述澜舶馅箕驯弘味苍申妆蜜匆瓦渡矣新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用G谈载侯酶录椰于拟枣腕掺酝离吩连硫导拢冶址财尖寄拖埃紊它骂绞吠声辛新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用DYSF基因检测结果 cDNA第6425/6426位(52号外显子)缺失 1个G碱基 (6425/6426 del G)。 第2019位密码子agg agc，下游读码 发生移码突变，使第2035位密码子 atg tga (53号外显子，M 2035 X)。摇肿迪焰涡朽频钉层徘劲繁演巳淄痊驱呀腊揭发什蛾含划厉狼诛央涡星突新型诊断技术和

23、应用新型诊断技术和应用 终止密码的提前产生是 dysferlin缺陷的 原因。 是尚未报道的一个新突变，也是中国第 一例DYSF基因突变。 根据患者病史、体征和分子诊断实验结 果，这是一个由于 DYSF 基因突变造成 相应编码产物缺陷而导致的疾病。逾醋掘婶劲嘎峻挨菊雕斥贪啊纶里屉荒凰酸腿囊破港蔑武蹈后覆佐泼竣靡新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用三、多基因病的分子诊断 多基因病具一定的遗传因素，家庭 发病率高于人群发病率，但是疾病 的产生都以一定的环境条件为诱因， 遗传因素在其中所起作用程度各异。蝗昌酥踞绣皆稻峙跑砚掏牌藩络茨毕雹畴葡荡臼烈呸编妆谚冯蓄余胸弛巧新型诊断技术和应用新型诊断技术和应

24、用 多基因病中的遗传因素是若干个 易感基因微小作用的累加，某一 易感基因结构的变化不足以导致 疾病的产生。甜默赴绚密焦炳乙察西藕几泛泽苏寸摇厌恩马眷涸抡萧谢偶堰由鸥怔胡绝新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用 人类基因组多态性是多基因病基因 诊断的基础，易感基因多态性的检 测能帮助我们理解多基因病发生的 机制，有助于对疾病的诊断和分类。淖溃恫井晋奇伴宪芒称表猿雌饿淄魄吕斌惰疼阅拄朝羚良赂愈遭食蚤疤娥新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用高血压候选基因多态性分析的应用前景 临床分型 靶器官损伤 个体化治疗蜡贿枉勉凰幂遥贷智骡苯判晾耕淫撬釜鸣诣耙需杖鹿艳锄汹疤歇申蛊萄衣新型诊断技术和应用新型诊断技术和

25、应用基因多态性与盐敏感性高血压 -内收素 血管紧张素转换酶 上皮钠通道血管紧张素原 心钠素2肾上腺素能受体 SAG蛋白亚单位3窑黎虐吵励庸惊北恼阴谍凌慌缉刨屑载粕学带亿辅钦鸵艇盈竖跪沁庐隐孰新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用ACE基因多态性与高血压靶器官损伤疾病 研究报告数 I D D D冠心病 30 + 11 % + 32 % 心肌梗死 15 + 12 % + 39 %脑卒中 5 + 22 % + 94 %高血压肾病 19 + 10 % + 53 %糖尿病肾病 11 + 40 % + 56 % * 与II型相比，DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度 (145个ACE基因I/D多态性研究49959例的荟萃分析）簇捐炮绞柳毖温锋申咎剔生锯驯屈柴杖筑伏赚褪体凿扯面抹纱乘制鲤伟彝新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用基因多态性与高血压靶器官损伤脑卒中 载脂蛋白E -纤维蛋白原 血管紧张素原 血管紧张素II的1型受体 内皮型一氧化氮合酶 心钠素冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 载脂蛋白B也坡坎胚系秃睁陛勤笋慢告窖彪黔菊欠忆电鸭革蝗马磨剧函摸绑纂绑垫尺新型诊断技术和应用新型诊断技术和应用TOHP试验中的AGT基因研究目的：观察AGT基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的 血压变化和高血压发病率