培养基配制21课件

1、 293T细胞在不同血清及不同浓度血清中的生长能力测试对比 细胞培养学习成果报告 赵锋 2016.6.19甘肃鹏程生物科技发展有限公司厂商产品货号批号Biological IndustriesTest进口NBCS04-102-1Biological IndustriesFBS04-001-1Biological IndustriesDMEM-Hg01-100-1Biological IndustriesPBS02-024-1Biological Industries胰酶03-050-1CORNINGT25V119297备注：用 _ 细胞培养I. 实验目的：293T细胞在不同血清及不同浓度血清中

2、的生长能力测试对比。II. 实验材料：宿主细胞来源：中国科学院上海细胞系 甘肃鹏程生物科技发展有限公司.实验步骤：1.细胞培养前操作程序 1.1 操作前准备步骤 1.1.1 培养基与胰酶等需用试剂，由冰箱取出，置于室温回温备用；同时开启生物操作柜风机和紫外光灯管电源，杀菌10-15分钟后切换至日光灯照明。 1.1.2 确认C02培养箱与自制培养箱的温度设定应为37C，二氧化碳浓度应为5 %。所有操作步骤中，要进入生物操作柜的物品，都必定要均匀喷洒过75%的酒精才可进入生物操作柜。操作人员戴上手套的手，进入生物操作柜之前，也需均匀喷洒过酒精。甘肃鹏程生物科技发展有限公司2.培养基配制 2.1 配

3、制三种培养基 DMEM-Hg+10%FBS DMEM-Hg+10%NBCS DMEM-Hg+20%NBCS 2.2无菌测试实验 取一个六孔板，每个孔加入3ml培养基，每 种培养基做两个平行，放入培养箱中培养3天，中间连续观察六孔板菌落生长情况。甘肃鹏程生物科技发展有限公司 2.2 培养基成分以及作用 培养基: 缓冲盐, 氨基酸, 维生素, 醣/碳源. 血清/生长因子: 生长因子, 贴壁因子. 培养环境: 氧气: 参与能量代谢. 5%二氧化碳: 维持酸碱平衡.甘肃鹏程生物科技发展有限公司 Glutamine为细胞主要ATP来源. 易分解, 半衰期: 4为一个月, 37 约一周. BI基础培养基:

4、 4 一年, 谷氨酰胺 100mg/L. 血清: 生长因子, 蛋白质, 脂肪, 醣类. 血清替代物: 生长因子/蛋白质. 贴壁试剂: 细胞外基质, 促贴壁因子. 甘肃鹏程生物科技发展有限公司3.细胞解冻 购买的细胞通常会将细胞、培养基和抗冻剂混合之后装在冷冻小管中冷冻并存放于液态氮桶。在开始细胞培养时，需将冷冻小管解冻。甘肃鹏程生物科技发展有限公司3.1操作过程 将冷冻小管（293T细胞）由液氮中取出置于室温回温当小管外面的霜溶化后就可拿到生物安全柜中操作以五毫升移液管吸取4mL新鲜培养基小心冲散管内冰块。用移液管将全部溶液转移至干净的15 ml离心管中，再加入5mL新鲜培养基，拿到离心机以1

5、000 rpm离心5分钟。甘肃鹏程生物科技发展有限公司 至生物操作柜中倒掉上清液，用移液管将残余液体吸走。 用干净的移液管抽取新鲜培养基，以吸放的方式将离心管中的细胞悬浮起来之后，即可将细胞与培养基转移至培养皿中，将培养皿放入培养箱中来培养。甘肃鹏程生物科技发展有限公司 隔日，为移除可能残余的抗冻剂，移除培养皿中原有的培养基，用移液管再次加入新鲜的培养基，继续于培养箱中培养。至此完成细胞解冻培养的程序。 观察无菌测试结果，在倒置显微镜下可以看到血清中的纤维凝结，无菌落生长，可以使用。甘肃鹏程生物科技发展有限公司4.细胞培养 将培养于培养箱中的细胞进行继代培养，或是根据实验需求进行分盘。甘肃鹏程

6、生物科技发展有限公司4.1操作过程将培养皿自培养箱中取出，于生物安全柜中用移液管抽去所有溶液。用移液管吸取3-5mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，加入至培养皿中，以轻微摇晃的方式润洗细胞层，之后用相同一支移液管将PBS 溶液吸取至废液收集瓶。甘肃鹏程生物科技发展有限公司吸取1-3mL的胰酶溶液，均匀加入至培养皿当中，放入培养箱中培养 3-10分钟(视不同细胞贴壁能力而定)。用移液管吸取新鲜培养基冲散细胞，将细胞悬液置于干净离心管并进行细胞计数。通过计数得到细胞浓度：5.3105个/ml甘肃鹏程生物科技发展有限公司通过计算，以总数1104个293T细胞接种到3种培养基中培养2天后，计算细胞总数。接

7、种过程：取一个六孔板，每个孔加入3ml培养基，每种培养基做两个平行，按100ul接种量接种到每个孔中，轻轻摇匀后放入培养箱中培养。甘肃鹏程生物科技发展有限公司 DMEM-Hg+10%FBS DMEM-Hg+10%NBCS DMEM-Hg+20%NBCS DMEM-Hg+10%FBS DMEM-Hg+10%NBCS DMEM-Hg+20%NBCS 每孔接种100ul293T细胞甘肃鹏程生物科技发展有限公司5.细胞计数 计算细胞浓度或是细胞数目、存活率。甘肃鹏程生物科技发展有限公司5.1操作步骤：取出血球计数板，用酒精擦拭其玻片与盖玻片表面。将盖玻片放置于玻片上。取Trypan blue 10 l

8、 于一干净 Eppendorf管上。用移液器以 10 l 的培养基将细胞重新悬浮起来，取出置于Eppendorf 管中，混合均匀。甘肃鹏程生物科技发展有限公司用移液器取微量混合液填充至其中一个 chamber 中(图右)。此时血球计数板用倒立显微镜以 10X 物镜观看 chamber 中央。甘肃鹏程生物科技发展有限公司数算区块 1、2、3、4、5 中的细胞数目之后平均，得到平均数 A。此估计法为A 在 50-200 之间时估计较准确。若此时 A 大于 200，则需稀释一倍之后再来计算，直到 A 介于 50-200 之间(图右)。细胞浓度 = A Dilute factor 104 cells/

9、ml.甘肃鹏程生物科技发展有限公司Viability = (The # of unstained cellsThe total # of cells) 100%细胞死亡后，细胞膜将破裂，此时 Trypan blue 进入细胞中，细胞将被染成蓝色；活细胞则不会被染色呈淡蓝色或白色。藉由颜色的区分来分辨活细胞与死细胞。计算五区的 viability 后取平均得到细胞存活率。甘肃鹏程生物科技发展有限公司6.实验结果DMEM-Hg+10%FBS-1：5/4 2 104=2.5 104个/mlDMEM-Hg+10%FBS-2：12/4 2 104=6 104个/mlDMEM-Hg+10%NBCS-1：0

10、/4 2 104=0个/mlDMEM-Hg+10%NBCS-2：0/4 2 104=0 个/mlDMEM-Hg+20%NBCS-1：19/4 2 104=9.5 104个/mlDMEM-Hg+20%NBCS-2：14/4 2 104=7 104个/ml甘肃鹏程生物科技发展有限公司7.鉴定血清的方法：理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量、球蛋白含量、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。甘肃鹏程生物科技发展有限公司微生物检测：包括细菌、真菌、支原体

11、、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22u的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。甘肃鹏程生物科技发展有限公司促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。有两种方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。（1） 贴瓶率测定：是以贴壁细胞为培养对象，将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿200或100个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养一定时间后弃培养基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清比较

12、，判断血清质量高低。甘肃鹏程生物科技发展有限公司 （2） 克隆形成率测定：一般以悬浮生长的细胞为培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成不同浓度，接种到96孔板，每孔200ul，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与对照的标准血清相比较，就可看出不同批号血清间的区别。比较低的浓度，更能观察出血清质量间的细微差别。甘肃鹏程生物科技发展有限公司 （3）连续传代培养法：是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中，待测血清配制为5浓度，一般于第七天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以上，观察细胞生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。甘肃鹏程生物科技发展有限公司对于使用者，判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中