免疫组化总结

1、免疫组化总结 免疫组化定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学( immunohistochemistry )技术或免疫细胞化学( immunocytochemistry )技 术。原理免疫组织化学染色方法的原理抗原(antigen)定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质(抗体和效应细胞)在体内或体外发生特异性结合反应的物质。抗原具有两种性能：( 1)免疫原性( immunogenicity )指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。(2)反应原性(re

2、actogenicity)指抗原分子与抗体或效应 T细胞等免疫应答产 物发生特异性反应的特性。抗原的分类 完全抗原、半抗原免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原抗体( antibody)定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B 淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。大部分抗体电泳后位于丫区带， 1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为

3、免疫球蛋白(immunoglobin ， Ig)。白体的种类:五类，即 IgA 、 IgD、 IgE、 IgG、 IgM 。免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG,个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。免疫组织化学染色的反应原理染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。免疫组织化学染色的显色原理1）基本原理荧光标记或酶标抗体的染

4、色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。间接法：是将酶标记在第二抗体上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体，单克隆抗体是由小鼠制备的。第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，同标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度

5、。 IHC 技术中，绝大多数以间接法为常用。2）显色的基本程序一抗孵育切片或细胞涂片二抗（酶标抗体）孵育切片发色剂显色（核复染）3）酶标抗体法的显色原理及显色剂辣根过氧化物酶（ horseradish peroxidase ， HRP ）HRP + H2O2 HRP - H2O2HRP - H2O2+ DH2HRP + D + 2H2OHRP 催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如：CN （4-chloro-1-naphthol）为蓝色TMB （tetramethyl-benzidine）为深蓝色AEC (3-am

6、ino-9-ethyl-carbazoie)为红色DAB (3, 3-diamino benzidine)为棕色碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是以AS-Mx为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。ALP 标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC 染色。由于组织细胞内含有内源性ALP ，在显色液中需加入终浓度为 2-4mol/L 的左旋咪唑(levamisole) ，大多数内源性ALP 活性可被抑制。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD )是以葡萄糖为底物的

7、酶， 其显色方法为B -D-葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、 PMS (phenazinemethyl-sulfate ) 0.167mg 、 0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml ， 37 孵育 1 小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。4)核复染在显色后，特别是用 DAB 显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水化后细胞核显示蓝色，与胞质中的 DAB 棕色形成对比。但用 AEC 显色后不能用苏木素做核复染，因为配制苏木素染料中使用酒精作为介质，可使AEC 的红色终产物褪色，且AEC 显色后只能用水溶性封固剂封片。

8、石蜡切片的免疫组化主要步骤洗载玻片：将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4 混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铭酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右 )，再将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于 Lys 带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。包埋组织：先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。切片：将包埋好的组织从模具上取

9、下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为 5um, 如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40温水中。捞组织：当组织载玻片置于40温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每种组织捞 5-6 张，其中 23 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上

10、，放入37温箱中烘干。脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精 -100%酒精 -95%酒精-90%酒精 -80%酒精 -70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min ，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话，就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15min。抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入 3%H2O2浸泡10min,从而 除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉 H2O2,在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓 冲液，放入微波炉中蒸煮 3min (中火) ，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位

11、点暴露出来。血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2 次，并将载玻片置于PBS中5min,洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血泣 使一些非 特异性的位点封闭起来，然后放入37温箱中半小时。血清稀释10倍( 900ulPBS: 100ul血清封闭液)。加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加 PBS。加完一抗后于 4冰箱中保存过夜。加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入 PBS中洗3次，每次5min,擦干组 织周围的 PBS 后加上二抗，然后置于37温箱中半小时。加SABC:将片子从温箱中取出，放入 PBS中

12、洗3次，每次5min,擦干组 织周围的PBS后加上SABC,然后置于37c温箱中半小时。SABC稀释100倍(990ul PBS: 10ul SABC)。SABC：链霉亲和素-生物素复合物(strept avidinbiotin complex ， SABC )法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。加显色剂：将片子从温箱中取出，放入 PBS中洗3次，每次5min,擦干组织周围的 PBS 后加上显色剂。 （显色剂的配置：在1ml 水中加 1 滴显色剂 A ，摇匀，然后加1滴显色剂B,摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀）A: DAB B: H2O2 C:磷酸缓冲液DAB:即：二

13、氨基联苯胺（3, 3 -diaminobenzidine）是过氧化物酶（Peroxidase的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织 3-5min 。脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精 -95%酒精-100%酒精-100%酒精 -二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2 min,最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置

14、于通风柜中晾干。冰冻切片的免疫组化组织取出后于-80或 -20保存，进行冰冻切片，切好的冰冻切片于-80或 -20保存。需要时取出室温恢复5 分钟，参照石蜡切片的染色继续染色。通常冰冻切片组织是不需要固定的，所以不需要抗原修复。细胞的免疫组化（ 1）固定：在细胞玻片上种上细胞，或涂片，用 PBS 清洗，用冷甲醇、丙酮固定110 min,或含3-4%多聚甲醛pH 7.4的PBS室温固定15分钟，再用冷 PBS 冲洗样品 2 次；（ 2）通透：若目标蛋白在细胞内表达，则通透是至关重要的一步。将样品在含0.25% Triton X-100 的 PBS 中孵育 10 分钟（目标蛋白为膜蛋白时不适用，因

15、为 Triton X-100 对细胞膜有损坏作用） ， PBS 冲洗细胞 3*5 分钟；（ 3）封闭及孵育：细胞在含1% BSA 的 PBST 中孵育 30 分钟，去封闭液，用含 1% BSA 的 PBST 稀释的一抗在湿盒中室温孵育1 小时或4过夜；弃一抗，用 PBS 洗 3*5 分钟，用含1% BSA 的 PBST 稀释的二抗室温孵育1 小时（避光） ；去二抗溶液，用 PBS 洗 3*5 分钟；（4）复染：DAPI （染细胞核）孵育细胞1 分钟， PBS 冲洗；（ 5）封固：在玻片上滴加一滴中性树脂封片，变干后显微镜下观察，于-20或 4避光保存（封闭好的切片于显微镜下观察常会出现下述问题

16、：无染色、高背景和非特异性染色，解决方法可见后续常见问题解答部分） 。免疫组化的关键环节标本固定 ： 固定的目的是：防止标本从玻片上脱落；除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin S液或mDF 液效果较好。脱水、石蜡包埋和制片 ： 脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。脱蜡和水化： 这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20 min,然后立即二甲苯1-3分别10 min （这个时间是

17、由二甲 苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60度3-4 h。水化 用梯度乙醇（由高到低） 。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。抗原修复： 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（分为：中性的、高 pH的等） 。一般用微波修复中 6min*4 次，注意微波修复后自然冷却 30min 左右直 至修复液的温度达室温。细胞通透：这主要是针对细胞免疫

18、组化而言， 目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用 Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（ 10um 厚切片）和免疫细胞化学中一般用 Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂， 一般在 PBS 中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1% 。石蜡切片 4um 左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。灭活内源性过氧化物酶和生物素： 在传

19、统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD 一般 3%过氧化氢灭活时间短点，可以 10 min 左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般 1030 min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后 4 度避光保存。血清封闭： 组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA 、羊血清

20、等，但不能与一抗来源一致。一般室温 10-30min,但也要防止封闭过度。一抗和二抗浓度和孵育时间： 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种： 4 度、室温、 37 度，其中 4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37 度 1-2h， 而 4 度过夜和从冰箱拿出后 37 度复温 45min 。 具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37 度 30min-1h ，具体时间需要摸索， 而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4 度最佳，反应温和，但时

21、间最好超过 1624h。抗体稀释液： 其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS 即可，但专用的抗体稀释液中除 PBS 成份外， 还加了叠氮化钠防腐剂、 BSA 稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。建议用专用抗体稀释液，但是使用前需要鉴定稀释的 pH 等，应与抗体相匹配。切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗） ： 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。建议用浸 洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的

22、物质。注意PBS的pH和离子强度的使用和要求，建议pH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01M 。 （中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由 DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色 较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出 现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要 下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；止匕外，若很短时间就出现背景很深， 还有

23、可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过 低或孵育时间过短（最好一抗 4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素 复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗 原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋 白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返 兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸

24、酒精中数秒（一定动作 要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。封片：为了长期保存，一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在 载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角， 接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液 体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。免疫组化常见问题石蜡切片和冰冻切片的比较？（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为制作石蜡切片时要高温烤 片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片； 但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组

25、织的抗原免疫活性，做免疫组化时不 需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原 弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上 都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者 都可，那就都能做。（ 3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80 度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA 降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到 4 微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。一抗的选择要点和技巧是什么？（

26、 1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免） 。（ 2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting ，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。（ 3）种属反应性的选择

27、（species reactivity ） 。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。（ 4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。（ 5）生产厂家的选择。不同厂商的抗体有专门的应用领域，可以查看该产品引用文献的情况来判断。免疫组化结果如何分析？（1）阳性着色细胞计数法。在40X光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组36 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。（ 2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j

28、 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。（ 3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色） 、阳性范围进行评分（ 14 分为 025%、2650%、 5175%、 76100%） ，最终可以分数相加，再进行比较。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。如何才能充分脱蜡？（ 1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题， 切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；（ 2）脱蜡的时间要根据季

29、节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多， 3-5 分钟就足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长， 10-20 分钟或更长。（ 3）当天切的切片，烧烤2 小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20 分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果或许更好。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。如何最大限度地降低组织非特异性染色？（ 1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来

30、控制。这是最重要的一条。（ 2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，有条件可以换用单克隆抗体。（ 3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织） ，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；（ 4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；（ 5）缩短DAB 孵育时间或降低DAB 浓度/过氧化氢浓度等；（ 6）适当增加PBS 冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤为重要；（ 7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。脱片产生的原因和如何防止脱片？（ 1）多聚赖氨酸玻片质量的问题，尽量选择可靠的供应商。（ 2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。（ 3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。（ 4）没烤好，时间短温度不够之类。（ 5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（ 6）修复的问题：抗原修