QuantiGene Plex 2.0的详细操作流程(抽滤法)

1、QuantiGenePlex2.0的详细操作流程（抽滤法）此流程除了洗脱步骤，其他步骤也适用于磁珠洗板机洗脱法，使用的是Panomics公司的试剂。操作流程简介：目标RNA的释放目标RNA的捕获信号放大4.检测以下将针对上述四大流程进行详细的说明。目标RNA的释放：此步流程即为组织细胞匀浆液的制备，鉴于本实验室所处理样本的类型，下面只介绍用RNAlater保存的样本和石蜡包埋切片处理样本的组织细胞匀浆液制备方法。实验开始之前，用RNaseZap处理所有物品的表面。保存于RNAlater中的组织其细胞匀浆液的制备方法此步骤不适用于下列类型的样本：骨肌肉胰腺胃空肠准备步骤：将新鲜组织放于5倍体积的

2、RNAlater中，4C孵化16-18小时。准备适量的匀浆溶液，每5mg组织300卩1匀浆溶液3卩1蛋白酶K漩涡震荡混匀用吸水纸将附在组织上的RNAlater吸除干净。组织匀浆液的制备。将组织和匀浆溶液转移到Dounce组织研磨器中，加入4-6颗不锈钢珠和适量玻璃砂，匀浆直至无可见的颗粒。将匀浆液转移至离心管中。65C孵化匀浆样品30min，在此过程中每隔1Omin最高速漩涡震荡lmin。注意：有些组织如连接组织需要更长的孵化时间（最长18h）来减少粘稠性。16,000 xg离心样品15min，沉淀细胞碎片，将上清液转移到新的离心管中，重复此步骤一次。立即使用组织匀浆液或保存于-80C冰箱中。

3、石蜡包埋切片组织匀浆液的制备测量和转移组织。测量长（L）和宽（W）,计算面积（LxW）mm2用干净的刮刀将FFPE样品完全刮入1.5ml离心管中，避免刮入过多的石蜡。注意：要保证足量的相当于50-60gm厚的组织样本，如果样本厚度为10ym，则放5-6片于一个离心管中。溶解组织。a.根据下表中的体积来加入匀浆液和蛋白酶K对于总厚度为50-60ym厚的组织片组织面积（mm2）匀浆液（卩1）蛋白酶K体积（卩1）25-1003003100-22560062259009b.65C孵化样本6小时。短暂地漩涡震荡样本，每过1小时漩涡震荡1min。室温下最大速度离心样品5min,沉淀细胞碎片，然后将匀浆液转

4、移至新的离心管中,避免石蜡和碎片残留，如有必要重复操作来去掉碎片。注意：在室温下离心会使残留的石蜡固化，在匀浆液表面会形成固态的石蜡残留。用移液管刺穿石蜡层吸取匀浆液转移。立即使用组织匀浆液或保存于-80C冰箱中。目标RNA的捕获Day11.准备下列试剂ProbeSet和BlockingReagent，融化，短暂漩涡震荡混匀，短暂离心，收集管底部的物质。CaptureBeads，用之前从贮藏处取出，避光。ProteinaseK,用之前从贮藏处取出，置于冰上。组织匀浆液，如果是冷冻的，室温下融化，37C孵化30min。对于管子，短暂漩涡震荡，对于板子，上下吹打5次，然后放置在室温下。注意：不要把

5、样本重新放回冰上。LysisMixture在37C下预暖30min,再轻柔地震荡。用匀浆溶液恰当地稀释组织匀浆液，使样品的需要量为每孔40卩1,要确保实验信号在仪器所能检测的范围内和实验线性范围内。4.通过结合下表中所列的试剂准备适量的WorkingBeadMix。注意：在加入之前漩涡震荡（最高速）CaptureBeads30sec。加入顺序试剂1well(gl)48well(gl)96well(gl)1Nuclease-freewater18.51,2402,4792LysisMixture33.32,2314,4623BlockingReagent21342684ProteinaseK0.

6、213275CaptureBeads16713462.0ProbeSet5335670总计604,020&040漩涡震荡WorkingBeadMix30sec，分别加入HybridizationPlate中，少于48个孔使用单管道移液器，每次转移都要更换一次新枪头，每孔中加入60glWorkingBeadMix。多于48个孔：用单管道移液器，将WorkingBeadMix转移到25ml试剂储藏池中。注意：不要倾倒，否则试剂将会出现损耗。使用排枪，每次转移都要更换一次新枪头，每孔中加入60glWorkingBeadMix。注意：包括3个孔的实验背景对照加入40卩1的组织匀浆液到含有Working

7、BeadMix的HybridizationPlate中。注意：加入40卩1的匀浆溶剂到作为背景实验的3个孔中。用压力封板膜密封HybridizationPlate。将压力封板膜放于HybridizationPlate中间。用软橡胶滚压器，平衡地滚压封板膜。将HybridizationPlate置于Shakingincubator中。54C1C孵化18-22小时，600rpm信号放大Day2实验开始之前：将AmplifierDiluent,LabelProbeDiluent,SAPEDiluent放于室温下。使AmpliferDiluent37C温暖20min,溶解沉淀，颠倒混匀。准备WashB

8、uffer：加入1个250ml的量筒中，按下列顺序150ml双蒸水(ddH2O)0.6mlWashBufferComponent110mlWashBufferComponet2用ddH2O将体积补足到200ml注意：每块板准备200mlWashBuffer转移到250ml的容量瓶中，来回颠倒混匀。WashBuffer现用现制。重要的预防措施：避免用手指或台面接触过滤板的底部。避免每个孔中的溶液溅出，交叉污染。在抽滤时，真空压力不要超过1-2英寸汞，否则CaptureBead将会丢失。检查过滤板底部是否有裂痕，不要使用破裂的板。不要让FilterPlate在空气中干燥，当抽滤结束时，立刻关上真空

9、抽滤装置，加入后续溶液。不要压FilterPlate的顶部，以免造成试剂的损失。尽量减少珠子暴露在室温下的时间。杂交2.0Pre-Amplifier:准备2.0Pre-AmplifierWorkingReagent简短离心2.0Pre-Amplifier，收集管子底部的物质。将3612.0Pre-Amplifier加入12ml的AmplifierDiluent中。来回颠倒数次。注意：AmplifierDiluent是一种粘性溶液，小心吸取保证所有的物质从移液管中排出，WorkingReagent完全转移到reagentreservoir中。预湿过滤板将WashBuffer装入100mlreag

10、entreservoir中。用铝箔将不用的孔密封起来。将FilterPlate置于FilterPlateHolder上。FilterPlate每个孔中加入100pl的WashBuffer,室温下孵化1min。将FilterPlate转移到vacuummanifold上，过滤掉WashBuffer。注意：确保真空过滤器的压力不超过Hg的1-2inches，抽滤时间是5-15s，必要时调整压力。关掉真空抽滤器，将FilterPlate放回FilterPlateHolder上。将过夜杂交的混合物转移至FilterPlate中。将HybridizationPlate从shakingincubator中

11、取出，240 xg室温离心1min。注意：调整shakingincubator的温度50C1C。上下吹打5次，完全将过夜杂交的混合物转移到FilterPlate中。将FilterPlate转移到vaccummanifoldandfilter上，完全过滤。立刻进行后续操作。洗掉未结合的样本小心地向每个孔中加入200gl的WashBuffer，完全过滤，将真空抽滤器关掉。重复上述步骤两次，一共洗三次。用吸水纸吸一下FilterPlate的顶部和底部，去掉残留的WashBuffer，将它放回FilterPlateHolder上。D.立刻进行后续操作。5.开始进行2.0Pre-Amplifierhyb

12、ridizationA.将2.0Pre-AmplifierWorkingReagent转移到25mlreagentreservoir中。每孔中加入1001的2.0Pre-AmplifierWorkingReagent非常轻柔地用铝箔密封好FilterPlate,用干净的，干燥的纸巾吸一下FilterPlate的底部。将FilterPlate置于shakingincubator中，50C1C,600rpm孵化1h杂交2.0Amplifier准备2.0AmplifierWorkingReagent简短离心2.0Amplifier,收集管底部的物质。将36但的2.0Amplifier加入到12ml的

13、AmplifierDiluent中。来回颠倒数次混匀。洗掉未结合的2.0Pre-Amplifier从shakingincubator中取出FilterPlate。取下试验孔的铝箔封板膜,完全过滤,关掉真空抽滤机。小心地向每个孔中加入200皿的WashBuffer,完全过滤，关掉真空抽滤机。重复上步两次,一共洗三次。用吸水纸吸一下FilterPlate的顶部和底部，去除残留的WashBuffer,放回FilterPlateHolder上。立刻进行后续操作。开始2.0Amplifier杂交将2.0AmplifierWorkingReagent转移到25mlreagentreservoir中。每孔中

14、加入100pl的2.0AmplifierWorkingReagent非常轻柔地用铝箔密封FilterPlate,用干净的、干燥的纸巾吸一下FilterPlate的底部。将FilterPlate放入Shakingincubator中，600rpm50C1C孵化1小时杂交LabelProbe准备LabelProbeWorkingReagent:A.短暂离心LabelProbe,收集管底部的物质。往12ml的LabelProbeDiluent中，加入36pl的LabelProbe漩涡震荡15s混匀洗掉未结合的2.0Amplifier从shakingincubator中取出FilterPlate。取下

15、试验孔上的铝箔封板膜，完全过滤，关掉真空抽滤机。小心地向每个孔中加入200gl的WashBfer,完全过滤，关掉真空抽滤机。重复上述步骤两次，总共洗三次。用吸水纸吸一下FilterPlate顶部和底部，完全去掉残留的WashBuffer，放回FilterPlateHolder上。立即进行后续操作。杂交LabelProbe将LabelProbeWorkingReagent转移到25mlreagentreservoir中。每孔中加入100pl的LabelProbeWorkingReagent非常轻柔地用铝箔密封FilterPlate，用干净的、干燥的纸巾吸一下FilterPlate的顶部和底部。将

16、FilterPlate置于shakingincubator中，600rpm50C1C孵化lh结合SAPE准备SAPEWorkingReagent短暂漩涡震荡SAPE混匀，短暂离心收集管底部物质。将36但的SAPE加入到12ml的SAPEDiluent中。漩涡震荡15s，避光洗掉未结合的LabelProbe从shakingincubator中取出FilterPlate。将试验孔上的铝箔封板膜取下，完全过滤，关掉真空过滤器。小心地向每个孔中加入200皿的WashBfer,完全过滤，关掉真空抽滤器。重复上步两次，一共洗三次。吸干FilterPlate的顶部和底部，去掉残留的WashBuffer放回F

17、ilterPlateHolder上。立即进行后续操作。结合SAPE将SAPEWorkingReagent转移到25mlreagentreservoir中。每孔中加入100pl的SAPEWorkingReagent非常轻柔地用铝箔密封FilterPlate,吸干FilterPlate的底部。将密封好的FilterPlate置于FilterPlateHolder上，用铝箔完全包裹好。置于shakingplatform上,室温600rpm摇30min检测洗掉未结合的SAPE将SAPEWashBuffer装入100mlreagentreservoir中。从shakingplatform中取出Filte

18、rPlate。从试验孔上取下铝箔,完全过滤,关掉真空抽滤器。小心地向每个孔中加入200gl的SAPEWashBfer,完全过滤，关掉真空抽滤器。重复上述步骤一次,一共洗两次,吸干FilterPlate的顶部和底部,放回FilterPlateHolder上。准备板子用于Luminex分析每个试验孔中加入130但的SAPEWashBuffer非常轻柔地去掉FilterPlate上的铝箔，吸干FilterPlate的底部。将密封的FilterPlate置于FilterPlateHolder上，用铝箔完全包裹。注意：这一步，板子在室温下黑暗中可放置不超过2h,或4C24h（无摇晃），当准备好读板时再进

19、行后续操作。将板子放在shakingplatform上，室温600rpm2-5min，立刻读数。注意：如果一次跑多于1块板子，将第2块板子置于室温下黑暗中（无摇晃）。当第1块板子读完数，仪器预洗结束，便将第2块板子放于shakerplatform上，室温600rpm摇2-5min,立刻读数。附录：Luminex维护定期清理样品probe/needle。Probe/needle生锈或有盐类沉淀，应该更换。每次实验后，按下表中列出的步骤来清洁probe/needle。步骤洗涤次数溶液清洁2x20%漂白剂回洗3xnone乙醇洗3x70%乙醇洗4x蒸馏水关仪器之前，比上述步骤多一步，浸泡1次，水。Qu

20、antiGenePlex2.0AssayKit中所含的试剂及其储存条件成分描述储藏ProteinaseK溶解在液态缓冲液中的proteinaseK-20CBlockingReagent含有防腐剂的液态缓冲液-20CLabelProbe液态缓冲液中的生物素酰化的寡聚核苷酸-20C2.0Pre-Amplifier溶解在液态缓冲液中的DNA-20C2.0Amplifier溶解在液态缓冲液中的DNA-20CAmplifierDiluent含有蛋白和防腐剂的液态缓冲液2-8CLabelProbeDiluent含有蛋白和防腐剂的液态缓冲液2-8CSAPE连接抗生蛋白链霉素的R-藻红蛋白2-8CSAPEDi

21、luent含有蛋白和防腐剂的液态缓冲液2-8CLysisMixture含有防腐剂的缓冲液15-30CWashBufferComponent】溶液15-30CWashBufferComponent2缓冲液15-30CSAPEWashBuffer缓冲液15-30CFilterPlate96孔过滤板15-30CFilterPlateHolder96孔，clearbottom聚丙烯微孔板15-30CPlateSeals涂有胶黏剂的铝箔封板膜15-30CHybridizationPlate96孔clear聚丙烯板15-30CPressureSealsClear,pressure-activated封板膜

22、用于overnighthybridizationplate15-30C故障排除表1故障原因解决方案组织过滤匀浆液中的所有细胞碎片未清除用“澄清匀浆溶液”过程预过滤样品组织是有弹性的难于匀浆这是用RNAlater或RNAlaterICE保存的一个已知现象米用我们推荐的方法来匀浆组织QuantiGene或QuantiGenePlexassays的灵敏性低样品没有保存在最佳环境中导致RNA降解米用panomics的样本评估对照来评价样本的量（18sDNA）和样本的质量（28sRNA）。如果样本的质量很差，采用我们推荐的液氮粉碎法未完全的样本匀浆，匀浆后仍有块状的组织使用我们推荐的液氮粉碎法来制备样本

23、QuantiGene或QuantiGenePlexassays的信号与样品的稀释倍数不成比例不完全的样品匀浆组织与匀浆液的比例太高减少组织样品的加入量（根据推荐的样品量与匀浆液的比例）信号低或灵敏度差表2可能的原因建议的解决办法RNA转录的数量低于检测下限增加样本的加入量信号扩大溶液没有正确制备小心正确地加入2.0Pre-Amplifier,2.0Amplifier,LabelProbe,SAPE加入话量的稀释液中充分混匀使用了过期的试剂试剂保质期半年次佳实验条件遵照推荐的孵化时间和温度，所有的孵化都需震荡MagneticSeperatioonPlateSAPE光致褪色在实验过程中SAPE应避

24、光不止确地使用Washbuffer用SAPEwashbuffer洗掉未结合的SAPE仪器的检测针部分堵塞根据操作者指南替换和清洗检测针不完全的细胞裂解见表1信号RNA的降解见表1背景信号过高表3原因解决方法探针没有预热加热探针到95C5min,置于冰上备用杂父混合物在过夜杂父前置于室温太长时间减少准备时间，保证杂父混合液在室温中的暴露时间不多于10min没有采用最佳实验条件严格按照实验操作流程进行使用了过期的试剂试剂保质期半年实验精确度低（高CV）表4原因解决方法吸取溶液不精确只使用校准的，精确的移液枪枪头要插牢每转换一次液体都要更换新的枪头小心慢慢地移液，避免产生气泡WashBuffer残留

25、设置洗脱机，每个洗脱步骤只有5-iom的残留样本不纯加热样本到37C，溶解沉淀，短暂漩涡震荡不完全的细胞裂解见表1仪器检测探针部分堵塞见表2Luminex溶液屮有气泡检查luminex探针的高度，然后米取仪器去气泡方案。确保每个孔包含130卩1的SAPEWashBuffer,Luminex样品量设为100卩1使用了含有沉淀的缓冲液加热到37C30min消除沉淀，轻柔地摇晃珠子的数量少表5原因解决方法CaptureBeads聚集在储臧管里在加入WorkingPlexSet之前，漩涡震汤悬浮珠子30sCaptureBeads在转入FilterPlate之前没有重悬在将杂父混合液转入MagneticSeparationPlate之前，上下吹打杂父盘中的CaptureBeads，使其悬浮。在读数之前，MagneticSeperationPlate没有充分震荡在读数之前，震荡Magnetic