8011戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程03

1、*制药有限公司第2页共23页戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程文件编码戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程颁发部门S0P-ZL-8011-03GMP办公室复印：1份修订者审核者质量部审核修订日期审核日期审核日期批准者分发部门质量部生效日期批准日期目的：建立戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程，确保仪器使用的规范化、标准化。范围：适用于戴安U3000高效液相色谱仪的操作。责任：QC主管、仪器操作员对本规程的实施负责。内容：内容：1、流动相的配制首先配制常用流动相以及泵后密封圈清洗液小瓶（5%-10%甲醇溶液）如下图（图1）。配制过程中有机相必

2、须用有机系0.45pm的滤膜过滤,水相或缓冲盐用水系0.45pm的滤膜过滤。然后超声20分钟，超声时应避免超声温度过高以使有机相挥发。一般流动相可以保存3天,含缓冲盐的流动相必须临用新配,注意水相、5%甲醇或10%甲醇溶液（清洗液）2、开机、仪器方法设置。2.1稳压电源打开JJW-3KVA稳压器“ON”位置，等2-3分钟稳定后，按下ON-LINE1KVA蓄电池电源前面板的“ON”等2-3分钟。2.2打开泵(Pump)、自动进样器(Sampler)及所需检测器后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。各部分自检成功后，方可进行以下各部操作。打开电脑，等5-7分钟，电脑稳定。打开软件，连

3、接仪器。打开变色龙软件控制面板双击电脑桌面的“变色龙Chromeleon7”图标。出现如下对话框点击“确定”后出现进样器界面(图2)：3*StAChromeleon用户容和密码Chromeleon7ChromeleonConsole角色(R)：三级操作权限取消帮助IC图2)更改仪器0返回Q创薙(C)文件(F)编辑(E)视图(V)工具(T)帮助(H)主页（H）.FumpModiiileSampler複快状态Disconnected|傳泵继续E马达5冲洗：OffUVji_nnnn谛选VO启动eWorkflow智能启动/关机台为U300O-01,根据需要选择操作的仪iUV.Connected=Dis

4、connectedTHERMO-PC_U3000S_U3000_01召图3）在主页项中连接“泵”，“Sampler(自动进样器)”，及所需检测器，UV是紫外检测器,FLD是荧光检测器，A2D是蒸发光和示差折光检测器(图4)。*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 页共23页戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程0启动巳Wcrkflow倉智能宕动/关机+超释放控制国监视基裁+祎材目竝主页QD1FlJJTlpA2DSamplerUVFLD审计启动g)从列U3000进样：杨健序列：采流速On)D.30ml/min23S3psi%A:2D.jC:0.0%

5、D:0.0进样亘样品环:Inject-2QQ-200-0-40Q-3210站:hI1-01-琶360nm|450nm.tT模式:StandardVWEJ-3100啟怏nm235曰期时间保f42017/12/242017/12/242017/12/242017/12/2415:14:42+08:0015:13:46+08:0015:12:40+08:0015:12:35+08:0062017/12/2415:10:52+08:0072017/12/2415:10:51+08:002017/12/2415:10:52+08:00HllHJ0启动eWorkflow+每智能启动/关机+輕释故控I凹监视

6、基戋+总祎材*|田目竝成=+斗致畀+主页迪FwnpA2DSamplerUVFLD审计启动（1）从列述流速伍力压力1000-1psiD.6DDml/min：2fl61psi50D命令D-5QQ-(图5)-1000I111I111I0.Q1.02.0仪._U3000冲诜冲洗流速：时间：通讨进样器:后瓷封圈猜洗混合腔32SulAnal)1:icalXA限直规液位:XB限值:如液位：轨限値:就液位：號D限値：利D液位：废液限值:废液液位:特机打开W*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 页共23页戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程将“通过进样器”后“

7、Yes”改为“NO”。关闭泵-更多选项界面，当电脑关闭或泵断开连接时，需执行此步骤。（图5-6）冲洗泵单击（图5）对话框的“继续”按钮，等一分钟左右出现连接按钮变绿，首先将B通道流动相调节100%，单击“冲洗”按钮，出现如下对话框（图6）：图7)排气阀”拧3圈左右，点击“忽略警告执行”按钮。依次按照BCDA顺序进行冲洗，结束后顺时针轻轻拧紧螺母，注意冲洗过程中流速必须为零。注意冲洗通道的比例必须是100%，当其他通道为比例0%时，A通道为100%。流速的调节一般选用90%甲醇或90%乙腈冲洗色谱柱，调节流速时需等如0.2ml/min的步进速度（每个平衡点保持0.5分钟以上时）进行流速的升降，当

8、达到0.6ml/min时，在此流速平衡20-30min后，进行等度流动相比列或梯度流动相初始平衡比例调整；在此流动相平衡20-30分钟后，调整到方法要求的流动相，并等待压力稳定后方可进行样品分析。当比例调整幅度大于40%的变化时，应进行过渡（选择两步或两步以上调整后达到所需要比例），通常先调节待加入流动相比例为5%-10%，平衡约5分钟以上，再调节比例到要求的浓度；梯度泵开机时通常选择有机相调节平衡流速，再逐步加入水相；含盐流动相系统应以调节有机相比例5-10%平衡约30分钟以上，再逐步转换到盐通道。注意当达到0.5ml/min及以上才能打开柱温箱、连接自动进样器以及紫外灯等。柱温箱的设置根据

9、实验要求，设置合理的温度，选择合适的色谱柱，试验没有要求时，默认柱温箱温度为30.002,注意柱温箱在待机状态时，流速最低为0.5ml/min,色谱柱不能用100%的纯水冲，最低为5%的甲醇或乙腈。自动进样器的使用进样针的清洗单击“进样器(Sampler)出现如下界面(图8)：在启动项下点击“灌注注射器”，执行清洗，当模块状态项下绿色的“Ready”方可进行下一步，依次按照“灌注注射器一清洗缓冲环一外部洗针洗缓冲环”页序清洗3遍。*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 #页共23页戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程鹽样品瓶（9）样品瓶托盘（图

10、10）点击“样品盘控制”命令项下的红区扇区位置“移动盘到前部”，当仪器面板出现“SamplePosition及InjectVolume”方可放置样品；盖上托盖。注意：当批处理正在运行时，不能打开自动进样器的样品盘放置样品，必须等当前批处理中断或停止，进样针清洗结束后，进样阀在“Inject”位置时，点击“盘控制”命令项下的红区扇区位置“移动盘到前部”，当仪器面板出现“SamplePosition及InjectVolume”方可放置样品；样品瓶位置必须与设置样品序列的位置一致。样品分析结束后及时取出样品瓶防止腐蚀。2.9紫外检测器单击“UV”出现如下界面（图11）；等10-20分钟，流速达到0.

11、5ml/min稳定时点击命令项“模块连接”按钮。*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 页共23页智能蒯却超释姙制盲胃融I西代上廊=斗險心、EJTiplerA2Din/FLD审计启动E)盹列W溢谨伍力mL/min范IS40DDFI-屈0-2C-AiribiEt_Temp压力Emissiun_lFLD_FlowCell76.0075.00-psimVcounts=C養动相XA-1C-C-肌-60-仝XC-1C-C-观-閃-仝200OO.L：iiTiphi：iUEe_TempPuuTip_PrezEm-e0UVVIS_1戴安U30OO高效液相色谱仪标准操作规程图12)*制药有限公司第 页共2

12、3页*制药有限公司第 页共23页根据需要选择监视的通道，紫外选择UV-VIS-1,蒸发光检测器选择A2D-Analog，示差选择A2D-Analog2,荧光选择的是Emission-1和FLD-FlowCell两个同时选中，然后点击确定开始基线监测（如图12）。2.10衍生化泵的连接需要连接衍生化泵时，将色谱柱流出端接到衍生化泵的红色螺母处。2.10.2将衍生化泵的Det端口出来的管路接至FLD检测器入口端。2.10.3荧光检测器的设置图15）当连接FLD时，点击FLD出现如下界面（图16）：*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 页共23页戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U

13、3000高效液相色谱仪标准操作规程图17)等20分钟左右，点击监视基线，做黄曲霉毒素时激发波长360nm；发射波长450nm；仪器校验时激发波长290nm；发射波长330nm,其他参数不变。2.11蒸发光散射检测器设置2.11.1用蒸发光散射检测器检测时，首先确认XWK-m全自动空气发生器干燥管内变色硅胶未变色（做1-2次样需更换变色硅胶），打开XWK-m全自动空气发生器开关，等压力稳定在0.44-0.48MPa之间时，打开蒸发光散射检测器（ELSD-UM3000）右下角电源开关;出现如下图所示界面（图17）：调节温度2.11.3按面板上“MENU”出现如图18所示界面，通过A、V、VI、A（

14、Te）至75oC，按面板上的“ENTER”键确定，如下图（图18）：上海通微分析技术有限公pJShanghaiInimicroIcellnologivsI.tl图18)2.11.4然后如下图所示界面，通过、V、调节流速F至2.50L/M，按面板上的“ENTER”键确定，如下图（图19）：上海通微分析技术有限公司ShanghniI111microIcchsnI*（图19）2.11.5按面板上的“RUN”键，再按面板上“VALVE”键，POWER、RUN、VALVE三灯全亮出现如下图20：图20）2.11.6当T=075、F=2.50P=3.10左右，再调节试验所需流动相。关闭蒸发光检测器时先停止

15、流动相，继续用空气吹30min左右，再按面板上的“VALVE”键，再按面板上的“MENU”键，再关黑色开关。再间断地按XWK-皿全自动空气发生器红色放液按钮，直至压力表上的压力为“0”，然后关机。蒸发光界面一般打开软件自动连接。模块状态显示连接（绿色）才可做样。如下图（图21）；图21）2.12示差检测器设置2.12.1将色谱柱流出端接到检测器“IN”端口，检测器“OUT”端口是废液流出端。按下左下角的电源开关，检测器显示如下（图22）：（图22）2.12.2设置操作参数。用左右方向键切换到参数设置界面。如下（图23）*制药有限公司第14页共2页*制药有限公司第14页共2页戴安U3000高效液

16、相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程图23)通过按上下方向键，切换当前显示的参数界面。顺序如下图所示(图24)。图24)*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 页共23页戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程参数设置说明（图25）No参數设置值单位初始值1记录仪范IflREC.RANGE（U5.05L,214.&鬣64,128,256,512（12阶）uRIU/lOmV5122积分仪范围1NTEG.RANGE128.512iiRIU/1024mV5123温

17、度TEMPERATUREOFF,30-50（步进1）r40斗时间常数TIMECONSTANT0.25+0.5,h152+芥6棉阶sec1.55极性POLARITY-卡6基线位移BASELINESHJFT0-200（步进50nRIU）07漏液传感器LEAKSENSORON.OFFONS铤盘锁闭KEYLOCKYES,NONO9初始化救值DEFAULFDATAYES,NONO请按照下列步骤更改参数设置：切换当前显示的参数界面至需要更改的参数；2.12.2.2按下确认键（ENTER）,参数部分的光标开始闪烁；2.12.2.3通过上下方向键来更改具体参数数值；2.12.2.4按确认键（ENTER）使新设

18、置的参数生效；2.12.2.5按ESC键返回监控界面；2.12.3将流动相的流速定为1ml/min通过参比池（冲洗）。2.12.4间隔十秒钟按下冲洗键（PURGE），以打开/关闭冲洗阀（当打开时，LED灯亮，流路通过参比池，再按一次就关闭），持续几分钟。2.12.5从上述步骤2.12.3开始让洗脱液流经参比池，保持约20分钟。2.12.6按下冲洗键（PURGE）关闭冲洗阀，流动相流入样品池。2.12.7等待基线稳定。2.12.8按归零键（Zero）自动调节零点。开始进样操作。2.13建立程序文件选择所要使用的仪器（图26）2.13.2点击文件菜单，再点击创建选择“序列”出现下（图27）色谱囹名

19、称类型级别位置进样里21仪器方法无RA1-1未知FLA110000无-RA1-2未知RM10000无RA2-1未知RA210000无RA2-2未知RA210000图26）LU新建序列向导X未知迸样生成类型为“未知”的进样11器进萍名称的格式辽1:IZI#p-#r样品數（V）进样次数（?）:进样里（0）:2:2:RA1:1.1611.999RAI.B510.0000.001.100.000ri7（图27）1、选择样品瓶数2、进样次数3、起始位置4、进样量选择好之后点击下一步出现下（图28）新建序列向导方达和报告指定方法和报告蚤数万法迓样仪器方法（I）:处理方法（F）:默训宜报告模板（R）:视囹设

20、量（V）:仅保存与所选抿告欖板的铤接町浏览.-F仅保存与所选视图设置的铤接通道(H):W_VIS_1合=返回下一步闻|取消F=图28）点击“浏览”选择仪器方法出现下（图29）、图29）点击黑色圈标注的图标选择U3000/U3000-01仪器方法出现下图一般常用的仪器方法有UV（紫外）、ELSD蒸发光检测器/示差检测器、FLD（荧光）检测器，根据样品检测要求选择所需要的检测器（图30）。2017/12/1516:23:35+08:002018/2/917:24:43+08:002018/1/189:07:42+08:002018/1/516:36:00+08:002017/12/2921:17:

21、55+08:002018/2/2818:42:44+08:00修改曰期注释容称夹夹夹夹夹夹件件件件件件文文文文文文一IEUI蒸发光检测器FLD方法一IUV冲洗方法一I反向冲洗色谱柱方法关机方法IT图30）仪器方法选定之后回到一下界面（图31）：5新崖序列向导方法和抿告指定方法和抿告埜埶万法迓择报告模板（X）：仪器方法co：处理方法（T）：chrom:/thermopc/U3000/告模板/QC扌艮告.report浏览仅保存与所选抿告檯板的铤接佃）视圏设蛊（V）:仅保存与所选视圏设置的铤接怕通1(H)：UVVIS1返回CB）下一步（X）图31)点击“下一步”完成新建序列完成接下来选择保存序列界面

22、（图32）：查栈：aU3000名称盘一I抿告模板一I处理方法关机一I检测柱效一I审计追踪一I仪器方法一I原料制制夹夹夹夹夹夹夹夹夹件件件件件件件件件文文文文文文文文文修改曰期连釋2017/12/1314:34:52+08:002017/12/1511:44:26+08:002017/12/1314:57:50+08:002018/4/2114:07:49+08:002018/6/2914:10:10+08:002017/12/1314:45:57+08:002017/12/1315:14:23+08:002018/7/2516:35:22+08:002018/4/129:52:57+08:00

23、对象容称通道:对象类型取消图32）选择需要保存路径，完成即可。所有检测器使用之前都应提前打开预热半个小时，波长调到所需波长，流动相调到做样需要的比例即可开始基线测试如（图33）腿序列*制药有限公司第 页共23页*制药有限公司第 #页共23页4.：-0.0图36)戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程4.：-0.0图36)戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程3、运行批处理程序如（图34）20180116-06|R开始Fl溜目钗列+电童找下一1b处理方法无易RA1T未知FLA15.000前列舒乐片虹通道）走里空闲无11HA1-2未知RA15.000前列舒乐片肛通道）定里空闲无n昵-1未知RA

24、25.000前列舒乐片嗣通道1定里空闲无JLA2-2未知RA25.000前列舒乐片何通道）定里空闲费F甬T未知眈；5.000前列舒乐片（期通道）定里空闲无另JLA3-2未知RA35.000前列舒乐片肛通直走里空闲无JJk-4-l未知RA45.000前列舒乐片虹通道）定里空闲无|fA4-2未知RA45000前列舒乐片（角通道）定里空闲进样里収仪器方法状态图34)新建序列的命名以前列舒乐为例如下（图35）图35)各品种对应各自的对照品及样品，修改完之后点击上方的“开始”即可做样。4、数据处理批处理完成后双击打开需要处理的色谱图进行积分处理如下（图36）：耒琳-2G1監亞匚总混:序列一匚hDE金on

25、Cl主页aAaA预置mAU进样C0-C0-C0-C0-8.0C0-C0-C0-C0-C0-VC0-ca-处理布局筛选V-i仁湮121935数据处理3I允過I鱼厘峰导航数据处理14.：-112.0-10.0-6.0-2.：-+201808M总混#5匕校正圉曲交结更围IS性世交互圏表K等直罔/3D圉陲l-t囹囤UV-Vis光谱囹遛进样架ts蠢饶腔嚴盘1窗格剪贴板n空白RA1-11淫羊產苗对照品RMT|淫羊產苗对照品RAT4期淫羊產苗对照品RA2T5期淫羊產苗对照品RA2-2E卤前列舒乐片KA3-1T色前列舒乐片RA3-28色前列舒乐片触4-19色前列舒乐片RA4-2昌+筛选KV_VIS_1Pujt

26、idPressureSTE和处妙法aAaA结果*制药有限公司第 #页共23页*制药有限公司第 页共23页4.5Cobra向导完成后在色谱图下方“组分表”项目中设置组分名称（图39）。戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程4.5Cobra向导完成后在色谱图下方“组分表”项目中设置组分名称（图39）。戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程raAaA4.2先点击结果aAaA二CT：】-TL严FL*再点击矫正处理-14.00.0租分区诫基线噪声范亀Cobra平滔宽度最小ill面积通道和进样类型VoidPeak=天团變止二打卄禁止=关诩|mAU10.0-min4.0匕0.010.015.020.025.0乂取消缩锁4.3再点击色谱峰下面检测项目中的“运行Cobra向导”如下（图37）检测组分克|校正未识别im且克|色谱圏扣除高绸检咂置算法灵）:Cobra运行Ccibria向导“,4.4出现Cobra向导后，选择积分区域（图38）飪Cobra