AFB1高效液相测定法衍生和未衍生的比较

1、HPLC柱前衍生法分析黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素（AFT）对有机体具有致突、致癌、致畸性，被列为可能的人体致癌物质。黄曲霉毒素在多种人类食物中被发现，如玉米、坚果、花生等等，以Bl、B2、Gl、G2的形式存在。AFTB1在动物体内可转变成两种主要代谢产物-AFTM1和AFTQ,前者的毒性和致癌性与AFTB1相近，主要存在于动物的尿和乳汁中。黄曲霉毒素可使用正相和反相液相色谱法分离，反相色谱法操作较容易、流动相毒性也较低，被广泛采用。使用反相液相色谱检测时，可通过柱前衍生法或柱后衍生法，提高AFTB1、AFTG1的检测灵敏度，使之与AFTB2、AFTG2在相近水平下检测。柱前衍生法无需专用柱后衍生

2、反应系统，方法简单。本方法通过三氟乙酸（TFA）柱前衍生，HPLC检测黄曲霉毒素B1。该方法可用于4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2同时检测，也可用于AFTM1检测。样品前处理取50pL黄曲霉毒素B1标样溶液（10ng/mL,溶剂苯-乙腈溶液（98:2v/v）,用氮气吹干,加入200L正己烷和100L三氟乙酸，混匀1min，室温下放置10min,氮气吹干，用乙腈水溶液（乙腈/水85：15v/v）50L重新溶解，混匀30s，经0.45m滤膜过滤，供液相色谱仪检测用。LC分析条件仪器：ShimadzuLC-20A液相色谱系统（含LC-20AT二元泵、CTO-20A柱温箱，RF-10AXL荧光检测

3、器，LCsolution色谱工作站）色谱分析条件流动相：甲醇：乙腈:水=1:3:6流速:1.0mL/min色谱柱：Shim-packGVP-ODS（4.6mm*10mm）；Shim-packVP-ODS（4.6mm*150mm,5m）激发波长365nm发射波长425nm柱温：40C进样量：10L分析结果黄曲霉毒素B1（AFTB1）标样色谱图及分析结果表1黄曲霉毒素B1分析结果标样浓度保留时间化合物(ng/mL)(min)峰面积峰高AFTB1衍生103.36832924637098AFTB1未衍生106.721126851024结论三氟乙酸柱前衍生法可用于AFTB1检测，增强其荧光强度，提高检测

4、灵敏度。通过以上实验检测AFTB1标样（10ng/mL），未经衍生标液的信噪比为42，衍生后信噪比提高至S/N=1434。图1衍生后AFB1标样色谱图2未衍生AFTBI标样色谱图HPLC柱前衍生化法检测中草药中的黄曲霉毒素来源：医学论文网- HYPERLINK 0引言黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)产生的一组结构类似的二呋喃香豆素的衍生物1。黄曲霉毒素具有致癌性、致突变性及致畸性，可引起肝细胞变性、坏死2。随着黄曲霉毒素限量的日益严格，对检测方法在灵敏度、定量准确度和自动化方面提出了新的要求。目前国际上测定

5、黄曲霉毒素常见的方法有生物鉴定法、薄层层析法(TLC)、酶联免疫分析法、高效液相色谱法。生物鉴定法主要用于定性，方法专一性差，灵敏度低，一般只作为化学分析法的佐证；薄层色谱法操作繁琐、污染大科技成果转化、定量差、耗时长；而酶联免疫法虽然操作简单、灵敏度高，但特异性差，一般只能达到筛选的目的，不能作为常规定量检测用3；荧光强度的目测精确性较差，特异性不强和安全性能较差，主要是半定量；高效液相色谱法(HPLC)的灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠4。因此建立一种利用高效液相色谱来分析中草药提取物中黄曲霉毒素的方法,是十分必要的5。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂水为三蒸水，甲醇(

6、色谱纯，SKchemicals公司)，三氟乙酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，乙腈(色谱纯,MERCK公司)，正己烷(色谱纯，Brudick&Jackson公司)。黄曲霉毒素B1(3pg/ml),B2(3pg/ml),G1(3pg/ml),G2(3pg/ml)(Sigma公司)1.1.2器材和仪器Waters1525高效液相色谱仪，Waters2475荧光检测器；HYA-II恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)；涡旋混合器(MS2Minishaker)；免疫亲和柱(LCTechGmbHAflaCLEANTM)；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-500；DHG-9070A星电热

7、恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；石英自动双重纯水蒸馏器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)1.1.3色谱条件色谱柱：SymmetryC18，5pm，4.6mmX250mm；流动相：乙腈，水；流速:1ml/min；荧光检测器：激发波长入ex360nm;发射波长入em440nm；进样量：20pl,洗脱条件见5。1.1.4标准液配制黄曲霉毒素混标品的配制：吸取购买获得的黄曲霉毒素对照品，用苯：乙腈(98:2)稀释为巾g/ml作为储备液。4C冰箱备用。移去黄曲霉毒素标准储备液各100pl分别稀释2倍(0.5pg/ml)，4倍(0.25pg/ml)，8倍(0.125pg/ml)，80倍(0.01

8、25g/ml)，800倍(0.00125g/ml)。1.1.5溶剂配制5mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH7.2)配制1）称取50.14gNa2HP04.12H20溶解于700ml水中。2）称取9.66gNaH2P04.1H20溶解于350ml水中。3）将上述两种溶液进行混合并加入42.5gNaCl,配制成pH7.25mmol磷酸盐缓冲溶液1mmol磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH7.2）配制取200ml的5mmol磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）稀释于800ml水中。4）磷酸盐缓冲溶液（PBS）/吐温（Tween-20）配制：取8ml吐温-20稀释于92mlpH7.2磷酸盐缓冲溶液中1.2材料

9、1.2.1样品提取精密称取药材粉末10g，加入甲醇-水（8:2）100ml和50ml正己烷，高速搅拌3小时，提取液静置分层，收集下层溶液备用6。取7ml滤液加入43mlPBS/Tween-20溶液稀释。1.2.2免疫亲和柱净化取50ml稀释后的提取液上AflaCLEANTM柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压；但必须保证过柱流速不大于2ml/min。用10ml蒸馏水清洗柱子，抽真空除去柱子中的残余的水，每次用1ml甲醇洗脱柱子，洗3次。第一次加入的甲醇需要保持5min时间，洗脱柱子，收集洗脱液。1.2.3样品衍生化处理洗脱液经缓和氮气吹干，加入300pl（正己烷：三氟乙酸=2:1），涡旋混

10、合器混匀30秒，室温下衍生15min，衍生液经缓和氮气吹干后，用200pl乙腈-水（20-80）溶液溶解，涡旋混合器混匀30秒，样品经0.22pml滤膜过滤后备用7。1.2.4样品测定精密吸取上述衍生化的供试品溶液20pl进样分析，外标法计算结果。2结果与分析2.1方法学考察2.1.1最低检出限根据信噪比S/N23为该物质的最低检出限，G1最低检测浓度0.13ug/kg，B1最低检测浓度0.32ug/kg，G2最低检测浓度0.32ug/kg，B2最低检测浓度0.13ug/kg。2.1.2标准曲线将黄曲霉毒素各标准品（不同浓度）分别进样20pl,获得的色谱峰峰面积对黄曲霉素的绝对量作回归，得到以

11、下的标准曲线。2.1.3日内精密度实验将衍生化后的对照品溶液每隔一个小时进样1次，连续进样6次，每次进样20pl7。以衍生化生成的化合物的峰面积值进行计算，结果黄曲霉毒素G1,B1,G2,B2的相对标准偏差（RSD）分别为5.0%，9.2%，4.3%,1.9%。2.1.4日间精密度实验将衍生化后的对照品溶液每天进样1次，连续进样6天，每次进样20pl7。以衍生化生成的化合物的峰面积值进行计算，结果黄曲霉毒素G1,B1,G2,B2的相对标准偏差（RSD）分别为9.0%，5.9%，3.5%，7.0%。2.1.5回收率实验本实验采用人参药材做回收率实验8。本实验添加标准品B1的浓度为0.6ug/ml

12、，B2的浓度为0.6ug/ml，G1的浓度为0.6ug/ml，G2的浓度为0.6ug/ml。样品制备：精密称取人参药材粉末10.000g，添加一定量的混合标准品溶液，加甲醇水溶液高速搅拌提取，余下操作同样品中检测黄曲霉素含量的操作相同。重复六次。2.2样品测定运用此方法选取以下药材进行黄曲霉毒素含量测定，结果见。3结论本文采用高效液相色谱法测定中草药中的黄曲霉毒素，不仅克服了酶联免疫分析法中易出现的假阳性结果，同时也克服了薄层层析法的繁琐步骤及对测定结果的干扰。该方法对结构复杂的中草药及其提取物中黄曲霉毒素的测定，样品的前处理、净化、衍生是实验成功的关键1。在样品的前处理过程中，对过免疫亲和柱

13、的样品溶液pH值有特殊的要求，样品溶液pH过高或过低，都会造成样品中黄曲霉毒素的损失。样品在氮气吹干过程中，要求氮气和缓，衍生化前样品液体必须彻底干燥，否则，杂质较多，影响样品峰的分离，产生较多的杂峰；进行氮气吹干时，如果干燥时间太长，会造成样品中黄曲霉毒素损失，也会影响检测结果。该方法简单，灵敏度高，特异性强，加标回收率好，结果准确可靠8，适合连续处理大量样品。中国医学论文网专业提供医学论文发表服务，并提供大量中药学论文，如有业务需求请咨询网站客服人员！参考文献(References)田随安，张焱，翟志雷.食品中的黄曲霉毒素(B1B2G1G2)HPLC法测定探讨J.医药论坛杂志，200&29

14、(12):28-29.冯靓，蔡增轩，谭莹，等.HPLC同时测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2J.中国卫生检验杂志，2007，17(3):511-513乙小娟、刘丽萍，酶联免疫法检测可可豆中的黄曲霉毒素J.预防医学情报杂志，2000,16(4):38-39何晖,张琳.高效液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素J.福建畜牧兽医，2009,31(2):23-24付成平，欧阳华学，刘瑜柱前衍生化高效液相色谱法测定中草药提取物中的黄曲霉毒素B1J.西南农业学报，2009,22(2):522-524.HiroshiAkiyama,YukihiroGoda.DeterminationofaflatoxinsB1,B2,G1andG2inspicesusingamultifunctionalcolumnclean-upJ.JournalofChromatographyA,2001(932):153-157.张雪辉，陈建民.免疫亲合柱净化HPLC柱后溴衍生化方法检测中药中黄曲霉毒素J.中国中药