基因表达调控和重组技术

1、关于基因表达调控与重组技术第一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月2主要内容 基因及基因表达调控相关概念 原核基因表达调控基本原理 真核基因表达调控基本原理 重组DNA技术相关概念 重组DNA技术基本原理第二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。 基因 （Gene）第三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月基因组（Genome） 来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核：单个环状染色体所含的全部基因真核：一个生物体的染色体所包含的全部 DNA，又称染色体基因组线粒体基因组叶绿体基因组第四张，PPT共七十

2、九页，创作于2022年6月Human Genome第五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月人类基因组计划（Human Genome Project, HGP） 1985年美国提出 计划投入30亿美元，15年完成 1990年正式启动 英、法、德、日、中国等先后加入中国的任务： 人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序， 该区域约占人类整个基因组的1。第六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月年10月 启动2000年 6月 完成草图2001年 2月 nature公布草图 Nature, 409 (6822): 860-921, 2001 2004年 10月 nature公布精度 99

3、%的测序图 人类基因数：2 - 2.5万 Nature, 431 (7011): 931-945, 2004HGP的进展The post-genome era is coming第七张，PPT共七十九页，创作于2022年6月谱主为生物学大师耗资200万完成 盼未来降价普及 助提早预防疾病“ 生命天书” 首份个人基因图公布 (2007.5.30) James Waston第八张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。重组DNA技术本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方法，

4、获得某一目的基因的无性繁殖系DNA克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理第九张，PPT共七十九页，创作于2022年6月10第一节 基因表达调控第十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月11一、基因表达的概念* 在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状。第十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 DNA RNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转录 翻译广义：包括 rRNA、tRNA的表达第十二张，PPT共七十九页，创作于

5、2022年6月13二、基因表达调控的意义 生物体基因数量很多，但在某一特定时期只有一小部分基因处于活化状态，能进行转录（例如，真核细胞约25基因具转录活性）。因此，机体内存在着复杂的调节机制，调节基因的表达。通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖。基因表达调控的意义：第十三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月14三、基因表达的规律* 阶段特异性 （时间特异性） 组织特异性 （空间特异性）第十四张，PPT共七十九页，创作于2022年6月15 阶段特异性 （时间特异性）甲胎蛋白 某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发 生，称时间特异性* 多细胞生物的不同基因在不同

6、发育阶段按特定 时间顺序开启和关闭，称阶段特异性*哺乳类nAChR： 胚胎型2(烟碱型乙酰胆碱受体) 成年型2第十五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月16 组织特异性 （空间特异性）在个体生长的某一阶段， 不同细胞有不同基因表达胰岛素：胰岛细胞血红蛋白：红细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞X YX Y AB第十六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月17四、基因表达的方式 有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为管家基因。这类基因的表达称为基本的基因表达* 。例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因基本的基因表达也是在一定

7、机制控制下进行（一）基本的基因表达第十七张，PPT共七十九页，创作于2022年6月18（二）可调节的基因表达 与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低,又称适应性表达；又称奢侈基因。 特点：不是细胞生命必不可少的 表达受外环境的影响较大，不恒定表达 有间断性和空间特异性 第十八张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 诱导 基因表达水平在特定环境中增高的现象 这类基因叫可诱导基因阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫可阻遏基因 DNA损伤：DNA损伤修复酶被诱导 色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏第十九张，PPT共

8、七十九页，创作于2022年6月20五.基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因激活 转录起始* 转录后加工及转运 mRNA降解 翻译及翻译后加工 蛋白质降解第二十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月21六、基因表达调控原理以mRNA转录为例DNA元件 调节蛋白RNA聚合酶活性*调控要素（一）转录起始调节基因表达第二十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 （1） DNA元件：具有调节功能的特异DNA序列操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组件所构成的一个转录单位。操纵子调节序列编码序列：编码蛋白质启动序列：结合RNA聚合

9、酶操纵序列：结合阻遏蛋白*1、原核生物第二十二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 操纵子结构编码序列 启动序列 操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)第二十三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT一致序列第二十四

10、张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 （2）调节蛋白特异因子 决定RNA聚合酶特异识别并结合 启动序列的能力（因子）阻遏蛋白 与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性 （负性调节）激活蛋白 促进RNA聚合酶活性（正性调节）第二十五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 （3） RNA聚合酶活性 DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节作用最终由RNA聚合酶活性体现。 启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对RNA聚合酶活性影响最大。 第二十六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月2. 真核生物（1） 顺式作用元件：（2） 反式作用因子： （3） mRNA转录激活及其调节第二十七张，PPT

11、共七十九页，创作于2022年6月28第二节 原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理第二十八张，PPT共七十九页，创作于2022年6月29一、原核基因表达及其调控的特点 1、转录与翻译两过程紧密偶联 3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导 的负性调节*2、普遍存在操纵子调节机制阻遏蛋白操纵序列结合阻遏解聚结合去阻遏 阻碍第二十九张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 4、转录产物为多顺反子mRNA 5、转录起始是基因表达调控的最关键环节*多顺反子mRNA：多个功能相关的基因串联， 转录产物在 一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链第三十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月31二、

12、操纵子理论通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基因（26个，甚至更多），还有其它调节序列。 编码序列 启动序列 操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)操纵子结构第三十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月32乳糖操纵子调节机制 阻遏蛋白的负性调节 CAP的正性调节 协调调节第三十二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 乳糖操纵子结构 CAP结合位点P IIPOZYA调控区结构基因I: 阻遏蛋白编码基因PI: 阻遏蛋白基因启动序列Z: -半乳糖苷酶Y: 透酶A: 乙酰基转移酶结构基因O:操纵序列（阻遏蛋白结合部位）P:启

13、动序列CAP结合位点调控区第三十三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 1. 阻遏蛋白的负性调节（无乳糖） *阻遏蛋白与O序列结合, 抑制转录, lac操纵子关闭阻遏蛋白mRNACAP结合位点P IIPOZYARNA聚合酶 第三十四张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列解离，转录抑制解除，lac操纵子开启乳糖别乳糖CAP结合位点P IIPOZYAmRNA 阻遏蛋白的负性调节（有乳糖） * 第三十五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 CAP: 分解代谢基因激活蛋白 catabolite gene activator protein同二聚体

14、cAMP 结合区 DNA 结合区第三十六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 2. CAP的正性调节（无葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P IIPOZYACAP结合位点mRNA无葡萄糖，cAMP浓度高cAMP与CAP结合 与CAP结合位点结合转录活性提高约50倍 第三十七张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 CAP的正性调节（有葡萄糖） *cAMPCAP蛋白P IIPOZYACAP结合位点mRNA有葡萄糖，cAMP浓度低cAMP与CAP结合受阻转录活性下降 第三十八张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 阻遏蛋白mRNACAP结合位点P IIPOZYARNA聚合酶 3. 阻遏蛋白

15、与CAP的协调调节*（1）无乳糖时, 阻遏蛋白封闭转录， CAP无作用第三十九张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 （2） 有乳糖时, 乳糖操纵子去阻遏, 虽可转 录, 但活性很低, 必须由CAP的正性调节来加强P IIPOZYACAP结合位点mRNA 第四十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 乳糖操纵子强的转录活性既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖第四十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月42（一）真核基因结构特点 1. 转录产物为单顺反子 一个基因 一条mRNA 一条多肽链2. 重复序列 高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列3. 基因不连续性 非编码序列 内含子1235

16、3三、真核基因表达调控第四十二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 （二） 真核基因转录特点活性染色体结构变化 对核酸酶敏感、甲基化程度降低、 组蛋白乙酰化修饰2. 正性调节占主导 真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有 实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用3转录与翻译分隔进行 转录在核内进行，翻译在胞浆进行第四十三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月44 转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用 1、顺式作用元件：2、反式作用因子： 3、mRNA转录激活及其调节（三）真核基因转录激活调节第四十四张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 1. 顺式作用

17、元件* 指结构基因两侧或内部具有调节功能的DNA序列，因其作用于自身分子并发挥作用，所以称顺式作用元件。 根据位置、性质及作用方式的不同分为启动子、增强子和抑制子。第四十五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月46 真核生物 顺式作用元件结构基因序列 启动子(promoter)P 抑制子(silencer) 增强子(enhancer) 增强子(enhancer)第四十六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月47RNA聚合酶II启动位点周围一 组转录控制组件常见组件： TATA盒（TATAAA） -25bp -30bp GC盒 （GGGCGG） CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒

18、TATA盒转录起始点-30bp -110bp启动子 promoter第四十七张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 增强子* ： 远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转 录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距 离无关。 抑制子* ： 对启动子转录活性起抑制作用的 DNA序列 负性调节元件第四十八张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 2、反式作用因子（转录因子） 转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白 基本转录因子 转录激活因子 转录抑制因子 第四十九张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 绝大多数转录因子属于反式作用因子*真核生物：由某一基因表达后，通过DNA

19、-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。第五十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 AB第五十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子 基本转录因子FEBDARNA pol TATADNATATA TFD TFA TFB TFF TFERNA pol第五十二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 转录激活因子 （正性调节因子） 通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起 正性调节作用的转录因子。 转录抑制因子 （负性调节因子） 通过DNA蛋白质、蛋白质蛋白质相互作用起负 性调节作用的转录因子。与增强子结合的转录因子与抑制子结合

20、的转录因子第五十三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月54真核RNA聚合酶II不能单独识别启动子，而是由基本转录因子TFIID识别并结合启动子，形成TFIID启动子复合物，然后有一系列的转录因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始复合物，调节转录的起始。3mRNA转录激活及其调节第五十四张，PPT共七十九页，创作于2022年6月55第三节 重组DNA技术第五十五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月基因重组（genetic recombination） 自然发生的基因重排 真核、原核均会发生 基因变异、物种演变、生物进化的基础基因工程（genetic

21、engineering）重组DNA技术人工进行基因重组第五十六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月57 克隆*(名词)：就是指来自同一母本的所有副本或 拷贝的集合。 克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程。二、重组DNA技术相关概念母本克隆clonecloning（一） 克隆与克隆化第五十七张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 细胞克隆： 从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞， 经扩增获得这样一类相同的细胞。在分子生物学领域所说的分子克隆专指 DNA克隆(DNA cloning)。 分子克隆： 从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合。第五十八张，PPT共七十九页，创作于202

22、2年6月59（二）重组DNA技术* 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的DNA）与载体DNA连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程。 第五十九张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 目的 DNA 载体DNA连接复制子（重组DNA）导入宿主细胞 （转化或转染）转化子细胞转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA 第六十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 基因克隆DNA 克隆重组DNA同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程

23、 获得DNA的无性繁殖系 获得目的基因的表达产物重组DNA的目的 第六十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月62（三） 工具酶限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶反转录酶多聚核苷酸激酶第六十二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 限制性核酸内切酶*识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别DNA的回文序列 * 。第六十三张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 Hpa I：5- GTT AAC - 3 3- CAA TTG -5平端Pst I： 5- CTGCA G - 3 3- G ACGTC -53突出

24、粘性末端EcoRI：5- G AATT C - 3 3- C TTAA G -55突出粘性末端第六十四张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 （四）目的基因 target genecDNA (complementary DNA) 在体外以RNA（通常为mRNA）为模板，经反转录合成的单链DNA。基因组DNA(genomic DNA) 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。目的基因又称外源DNA第六十五张，PPT共七十九页，创作于2022年6月66 携带外源DNA，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体： 质粒 噬菌体DNA 病毒DNA质粒

25、（1）双链环状DNA，细菌染色体外 （2）2 - 3kb 或 数百kb （3）独立自主复制，稳定遗传 （4）遗传标志 (五) 基因载体 （克隆载体）第六十六张，PPT共七十九页，创作于2022年6月67三、重组DNA技术的原理 与基本过程*1. 获取目的基因2. 选择、构建基因载体3. 目的基因与载体连接，形成重组分子4. 重组分子导入受体细胞5. 筛选、扩增6. 表达目的基因第六十七张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 +载体目的基因重组DNA分子细菌转化或转染扩增筛选第六十八张，PPT共七十九页，创作于2022年6月69（1） 化学合成 （4） PCR（2） 基因组DNA文库 （3）

26、 cDNA文库 1. 获取目的基因第六十九张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 组织或细胞染色体 限制性内切酶多个DNA片段载体多种转化子 （基因文库）重组DNA 导入宿主细胞mRNA逆转录cDNAcDNA文库第七十张，PPT共七十九页，创作于2022年6月71聚合酶链式反应（PCR） 在有特定模板、特异DNA引物及合成DNA所需要的dNTP存在时，向DNA合成体系内加入耐热的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶* ），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。 第七十一张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 变性：解开模板双链DNA 95 退火：使引物与单链模板DNA结合 55 延伸：DNA链的合成 72 第七十二张，PPT共七十九页，创作于2022年6月 2. 克隆载