选修3-12基因工程的基本操作程序

1、1.2 基因工程的基本操作程序目的基因的获取1基因表达载体的构建23将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定步骤一、目的基因的获取12概念？方法？探究1互动课堂 1、目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因2、也可以是具有调控作用的因子方法1、从基因文库中获取目的基因123含义？种类？依据？探究2互动课堂提取某种生物的全部DNA用适当的 限制酶一定大小的DNA片段将DNA片段 与载体连接导入受体菌中储存基因组文库基因组文库的构建cDNA文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期

2、的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体 连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA 聚合酶导入受体菌 中储存问题1 为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？某个时期的发育是基因选择性表达的结果 怎样从基因文库中获取我们所需的目的基因呢?（获取依据） 根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。问题2原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区原核细胞的 基因结

3、构调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子方法2、利用PCR技术扩增目的基因123前提？原理？过程？探究3互动课堂4条件？方法2、利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪(一)、PCR技术扩增过程 1.高温变性（90-95）： 双链DNA模板在热作用下， 断裂，形成_ 2.低温退火（55-60）： 与 模板结

4、合,形成局部双链。3.适温延伸（70-75）：合成链在 作用下延伸，合成互补的DNA。 Taq酶DNA引物单链DNA氢键方法2、利用PCR技术扩增目的基因PCR之歌PCR之歌There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and

5、some primers,Nucleotides and polymerases, too.Denaturing, annealing, and extending. Well its amazing what heating and cooling and heating will do.PCR, when you need to detect mutations. PCR, when you need to recombine. PCR, when you need to find out who the daddy is. PCR, when you need to solve a cr

6、ime. 从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。这时有个家伙叫Kary Mullis博士的，他钻出来说体外合成也一样OK！只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷和聚合酶。变性，退火，和延伸。加热冷却加热太神奇了！当你想要检测突变，来啊做PCR吧！ 当你想要基因重组，来啊做PCR吧！ 当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧!当你想要侦破大案，来啊做PCR （二）操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物引物（一小段单链DNA）（三）原理：（四）条件DNA的复制DNA聚合酶（耐高温）温度控制原料(脱氧核苷酸)模板（五）扩增形式：指数形式（2n）（目的基因）方法3：

7、通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪推测推测合成前提：基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸顺序mRNA核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因步骤二：基因表达载体的构建12目的？组成？探究4互动课堂步骤二：基因表达载体的构建基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等表达载体的组成启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基

8、因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端步骤三：将目的基因导入受体细胞内12转化？方法？探究5互动课堂 步骤三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细

9、胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达过程：1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。 适用：单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还未愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点:十分简

10、便经济。 例：转基因抗虫棉2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态 细胞感受态细胞 吸收DNA表达载体与感受态细胞混合 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？ 不一定，需要检测1、鉴定分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N

11、14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段方法DNA分子杂交技术变性变性1、鉴定分子水平的鉴定变性方法分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N1、鉴定分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入

12、目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.D课堂练习3、有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D【拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。课堂练习4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达C【拓展深