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文档简介
1、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 MALDI-TOF-MS涂杰2021年5月19日目录 MALDI-TOF的介绍 仪器分析 应用 结论及展望质谱分析原理 质谱方法(Mass Spectroscope,MS)是通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的研究。质谱仪通过测定离子化生物分子的质荷比便可得到相关分子的质量。但长期以来,质谱方法仅限于小分子和中等分子的研究,因为要将质谱应用于生物大分子需要将之制备成气相带电分子,然后在真空中物理分解成离子。但如何使蛋白分子经受住离子化过程转成气相带电的离子而又不丧失其结构形状是个难题。什么是MALDI-TOF
2、-MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometer 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来开展起来的一种新型的软电离生物质谱,其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。、已广泛应用于多肽、蛋白质、低聚核苷酸和低聚糖.1992年Karas等又把MALDITOFMS用于合成高分子分子量与分子量分布的测定。MALDI-TOF-MS 特点优点: (1) 质量检测范围宽 (2)质量的准确度高, (3) 样品量只需1mol甚至更少 (4)分析速度快,分子离子峰
3、强,信息直观 (5)对样品要求很低,能忍耐较高浓度的盐、缓冲剂和非 挥发性杂质 。根本原理 MAIDITOFMS的根本原理可简单的描述为:被测高分子样品或生物大分子以一定的比例与一小分子基质化合物溶液相混合。使得所测样品以单分子状态分散在基质中。枯燥后,一脉冲激光照射到基质和样品上,由于在这一激光波长下,样品投有吸收,而基质有强烈的吸收,所以基质吸收能量而激发解吸, 由于能量高,激发过程导致基质爆炸,从而使样品链被逐出并离子化。这一过程并不导致高分子发生链断裂,通常只生成分子离子以及分子离子的多聚体。离子化的分子在强电场的作用下被加速,获得动能(KE),然后沿飞行管无场区飞行,离子的飞行服从如
4、下方程:根本原理 KE =I2MV (1) 上式中,M 为离子的质量,v为离子的飞行速度,设飞行管长度为x,飞行时间为 ,那么飞行速度为: V = X/ T (2) 将(2)式代人(1)式,整理后得:M = 2KE( X/ T )2 = k( T)2 (3) 即离子的质量与其飞行时间的平方成正比。通过分子量的样品来校正常数k ,即可通过测量离子在管中的飞行时间来求其分子量,由于用脉冲激光作为电离手段,容易实现精确计时,一般与飞行时间质谱仪相结合。样品准备 在“MALDITOFMS 中,样品的制备直接影响激光解吸电离的效率和质谱的重现性,分辨率和准确性。主要有四类样品制备方案:微滴枯燥法快速结晶
5、法薄层法电喷雾注入法基质的作用 基质相当于样品分子的“溶剂 ,样品分子被基质彼此分开,这种别离作用削弱了样品分子问的相互作用。 基质分子从激光脉冲中吸收能量并转化为固态溶体体系的激发能,使微量样品产生瞬问相变。在形成离子过程中有两个临界值,低的是外表解吸,高的是本体解吸,后者给出离子信号。基质的选择 首先,基质必须在一些常用的蛋白质和高分子溶剂中有好的溶解性,因为在样品准备过程中基质要和蛋白质、高分子溶于同一溶剂中。,常用的溶剂有:四氢呋喃,水一乙腈混合物,水一乙醇混台物,70 的甲酸等。 其次,基质必须能很好的吸收激光,使能量沉积在基质中而不是分析物上。 另外,基质的反响活性必须考虑。能对蛋
6、白质或其它分析物起共价修饰作用的基质不能采用。氧化剂会破坏二硫键,使半胱氨酸基团氧化,应防止使用。醛类化合物也不适宜,他们修饰氨基酸N一端。2. 仪器介绍 仪器主要由两局部组成:基质附助激光解吸电离离子源MALDI和飞行时间质量分析器TOF。MALDT 原理 MALDI的根本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。它是一种软电离技术,适用于混合物及生物大分子的测定。MAL
7、DI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionizationhn Laser1. Sample (A) is mixed with excess matrix (M) and dried on a MALDI plate.2. Laser flash ionizes matrix molecules.3. Sample molecules are ionized by proton transfer from matrix: MH+ + A M + AH+.AH+20 kVVariable Ground Grid GridSample plateTOF 原理
8、TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比M/Z与离子的飞行时间成正比,检测离子。Time-of-flight mass analyzer+SourceDrift region (flight tube)detectorVIons are formed in pulses.Small ions reach the detector before large ones.Measures the time for ions to reach the detector.两种主要类型的 MALDI-TOF3.应用 分子量的测定 分子量是有机化
9、合物最根本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术,不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术,目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。 蛋白质组学中的质谱技术肽质量指纹谱技术PMF 蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的
10、一步。采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱PMF在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质,是目前蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。肽质量指纹谱是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列一级结构都不同,当蛋白被水解后,产生的肽片段序列也各不相同,因此其肽质量指纹图也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时,能耐受适量的缓冲剂、盐,而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子,因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。 蛋白质组学中的质谱技术肽序列标签技术PST 由于PMF鉴定结果的可靠性受诸多因素影响,使得局部鉴定结果往往不是
11、十清楚确,特异性不高。多肽氨基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。 在反射式MALDI-TOF-MS中,当脉冲激光照射到微量样品与饱和小分子基质混合形成的共结晶上时,能量通过基质传递给样品,导致样品被解析电离,电离后形成的亚稳分子离子在飞经无场区即飞行管区时发生裂解其活化能来自在离子源与基体发生的碰撞,在无场区与残留气体的碰撞,激光辐射及各种热机制等所产生的子离子即源后分解碎片离子,可以通过不断改变反射器电压来进行别离、收集并记录于检测器,形成能为多肽和蛋白质一级结构提供十分丰富而有效的结构信息的PSD质谱图。利用PSD谱图,结合数据库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。 研究生物样品的别
12、离和鉴定 由于MALDITOFMS使用激光作为电离手段并使用生物大分子不共振吸收的激光波长,保证了生物大分子在电离过程中不发生裂解,只出准分子离子峰,所以只要生物大分子的分子量不同就可以把它们同时鉴定出来。MAIDIToFMS可以用于蛋白质的混合物的各个组分的同时测定MALDITOFMS也是分析小肽混合物的有利工具。MALDI-TOFMS在高分子研究中的应用高分子分子量及其分布的测定 由于MALDITOFMS中的检测器对被测分子的分子量没有限制,因而可直接从检测的分子离子峰的质量数得到样品中每一根分子链的分子量,并根据谱峰强度计算平均分子量和分子量分布。末端基的测定 从分子离子峰的质量数还可以推断出高分链的末端基结构。从其质量数可推断出该类预聚物含有几种不同的反响末端基从谱峰强度可得到各类末端基的相对含量。共聚物和共聚反响的研究MALDI-TOF 典型结果4. 结论与展望 MAIDI一TOFMS能准确快速测定生物大分子和高分子的分子量。在生物大分子方面还用于测定生物大分子的一级序列结构,给出其混合物信息。在生物大分子方面的应用越来越受到关注。在高分子方面,所测得的高分子平均分子量和分子量分布指数与OI712等常标准方法相一致;能用于高分子末端基的检测,从而推断聚舍反响机理;也能用于共
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